黃 銳，袁 淵，任桂林，趙 劍，楊思進(jìn)，李 志，蒲清榮

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川瀘州 646000）

痛風(fēng)（gout）是由單鈉尿酸鹽（MSU）沉積所致的晶體相關(guān)性關(guān)節(jié)病，與嘌呤代謝紊亂和（或）尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關(guān)，特指急性特征性關(guān)節(jié)炎和慢性痛風(fēng)石疾病〔1〕。中醫(yī)藥學(xué)在痛風(fēng)的防治方面以清熱利濕、活血止痛為原則，顯示出縮短病程、降低費(fèi)用、減少并發(fā)癥等獨(dú)特優(yōu)勢，已得到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的認(rèn)同〔2〕。隨著國內(nèi)外對(duì)痛風(fēng)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制與炎癥反應(yīng)和免疫機(jī)制密切相關(guān)〔3〕。茜花制劑原方是治療痛風(fēng)的經(jīng)驗(yàn)方，由茜草、花椒、通草組成，日服量不超過20 g原生藥材，具有涼血散瘀、通絡(luò)止痛、清熱利尿的功效，主要用于治療痛風(fēng)引起的關(guān)節(jié)或肌肉的紅、腫、熱、痛、麻等癥。

由于原方是用60度以上的高粱酒浸泡而成的酒劑，味苦，課題組在不降低臨床療效的基礎(chǔ)上，從口感、制劑成本、生產(chǎn)時(shí)間等多個(gè)方面考慮，擬將酒劑改為膠囊劑，本試驗(yàn)結(jié)合藥效學(xué)試驗(yàn)優(yōu)選茜花制劑的初步工藝，并利用正交試驗(yàn)以有效成分的相對(duì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳提取工藝，為茜花制劑的實(shí)際生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器日本島津高效液相色譜儀（LC-20AT泵、SPD20A檢測器、CTO-10AS進(jìn)樣器、LcSolution色譜工作站）；AUW120D電子天平（日本島津）；JP全數(shù)字超聲波發(fā)生器（武漢嘉鵬電子有限公司）；AU680全自動(dòng)生化分析系統(tǒng)（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2試劑對(duì)照品大葉茜草素（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111898-201102）；茜草、花椒、通草均購自瀘州天植中藥飲片有限公司，批號(hào)分別為160201、160101、160101，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室趙劍主任中藥師鑒定，符合《中華人民共和國藥典》（2015年版）一部該藥材項(xiàng)下規(guī)定；酵母膏（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20160518）；腺嘌呤（武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)：03-004-1603009）；甲醇、乙腈為色譜純；水為純凈水；其他試劑為分析純。

1.3材料雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（川）2013-2017。

2 方法

2.1提取工藝

2.1.1 水提 按處方比例花椒除外稱取3倍全方藥材，加12倍水煎煮3次，每次1 h，過濾，濾液合并，濃縮成1 g/mL，加入花椒粉即為樣品溶液，備用。

2.1.2 不同濃度的醇加水提 按處方比例花椒除外稱取全方藥材，加入6倍量不同濃度的乙醇浸泡48 h，滲漉速度為1 mL/min，收集滲漉液，備用。藥渣加處方量12倍水煎煮3次，每次1 h，過濾，濾液與上述滲漉液合并，濃縮成1 g/mL，加花椒粉即為樣品溶液，備用。

2.2大葉茜草素的含量測定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取大葉茜草素的對(duì)照品適量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.153 g/L的對(duì)照品溶液。

2.2.2大葉茜草素的相對(duì)含量測定 取“2.1”項(xiàng)的各樣品溶液，用65%乙醇定容至600 mL，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 除茜草外按處方比例取藥材，按“2.1.2”項(xiàng)提取，按“2.2.2”項(xiàng)制備，即得。

2.3藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 給藥劑量 茜花制劑臨床經(jīng)驗(yàn)用量為16 g原生藥，成人每日用量為0.266 7 g/kg（成人體質(zhì)量按60 kg計(jì)），按成人給藥劑量乘6.25計(jì)算大鼠給藥劑量。

2.3.2 高尿酸血癥大鼠模型制備和給藥 取SD雄性大鼠96只，隨機(jī)分為8個(gè)組，每組12只，分別為正常組、模型組、別嘌醇組（3.5 mg/kg）、5個(gè)實(shí)驗(yàn)組。除正常組外，其余各組大鼠灌胃給予酵母膏15 g/kg和腺嘌呤200 mg/kg，每日1次，于第7天灌胃給予各實(shí)驗(yàn)組大鼠對(duì)應(yīng)劑量的藥物，正常組、模型組給予等量蒸餾水，每日1次，持續(xù)7 d，第7天給藥1 h后斷尾取血檢測尿酸水平〔4-6〕。

2.4正交試驗(yàn)選“2.2”與“2.3”項(xiàng)大葉茜草素含量較高，且藥效較好的實(shí)驗(yàn)組，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)粉碎粒度、乙醇用量、浸泡時(shí)間、滲漉速度4個(gè)因素進(jìn)行考察。

2.5數(shù)據(jù)處理與分析所有數(shù)據(jù)使用Excel建立數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以（±s）表示，統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析，組間數(shù)據(jù)比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1大葉茜草素含量測定結(jié)果

3.1.1 色譜條件 色譜柱Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液（25：50：25），流速1.0 mL/min，柱溫40℃，檢測波長250 nm，進(jìn)樣量10μL〔7-9〕。見圖1。

圖1 茜花制劑高效液相色譜圖

3.1.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.4、0.8、1.0、2.0、4.0 mL分別于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，按“3.1.1”項(xiàng)下色譜條件，取10μL進(jìn)樣檢測。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=4.056×107x+16 607.83，r=0.999 6，線性范圍為0.006 12～0.061 20 g/L。

3.1.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液10μL，按“3.1.1”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得大葉茜草素峰面積RSD為0.93%，表明儀器精密度良好。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h按“3.1.1”項(xiàng)色譜條件測定，大葉茜草素峰面積的RSD為1.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取正交試驗(yàn)1號(hào)樣品，按“3.1.1”項(xiàng)進(jìn)行測定，進(jìn)樣6次，計(jì)算得大葉茜草素平均含量為34.82μg/mL，RSD為1.82%。

3.1.6 回收率試驗(yàn) 精密量取正交試驗(yàn)1號(hào)樣品6份，每份1 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加入“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液0.2 mL，加甲醇定容至刻度，搖勻。按“3.1.1”項(xiàng)色譜條件測定，計(jì)算回收率。加樣回收率平均值為98.18%，RSD為1.4%，表明該方法切實(shí)可行。

3.1.7 大葉茜草素含量測定 取“2.2.2”項(xiàng)制備的供試溶液，按“3.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定。

3.2藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果模型組大鼠尿酸水平比正常組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示造模成功；別嘌醇組、65%工藝組大鼠尿酸水平與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而與模型組比較，兩組大鼠尿酸水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明持續(xù)給藥第7天，僅別嘌醇組與65%工藝組能顯著降低高尿酸血癥大鼠尿酸水平。見表1。

表1 不同提取工藝對(duì)大葉茜草素含量和高尿酸血癥大鼠尿酸水平的影響

3.3正交試驗(yàn)由表1可知，65%工藝組大葉茜草素含量為174.04μg/mL，較其他工藝組高，藥效學(xué)試驗(yàn)也表明該組能顯著降低高尿酸血癥大鼠的尿酸水平。因此，選用65%乙醇作為滲漉濃度，選擇粉碎粒度、乙醇用量、浸泡時(shí)間、滲漉速度為考察因素，收集滲漉液，測定大葉茜草素的含量，正交試驗(yàn)因素水平見表2。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3，方差分析見表4。由試驗(yàn)結(jié)果可知，各因素對(duì)提取效果影響主次為A＞B＞D＞C。方差分析結(jié)果顯示因素A即粉碎粒度和因素B即乙醇用量對(duì)滲漉工藝有顯著影響，因素C、D無顯著性影響，選擇最佳提取工藝為

表2 正交試驗(yàn)因素水平

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析

3.4復(fù)核試驗(yàn)按處方比例稱取藥材3份，按優(yōu)選的提取工藝A3B3C1D2即將藥材粉碎過五號(hào)篩，加8倍量65%乙醇浸泡24 h，滲漉速度為2 mL/min進(jìn)行提取，按“3.1.1”項(xiàng)下方法測定大葉茜草素含量為216.27、216.71、213.03μg/mL，RSD為0.93%，提取率為60.45%、60.58%、59.55%，RSD為0.93%。說明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，提取率較高。

4 討論

君藥茜草具有涼血、止血、祛瘀、通經(jīng)功效，用于吐血、衄血、崩漏、外傷出血、經(jīng)閉瘀阻、關(guān)節(jié)痹痛、跌撲腫痛〔4〕，是茜花制劑中涼血散瘀、止痛作用的主要藥物，其主要成分大葉茜草素是從茜草中分離出的萘醌類化合物，具有明顯的生物活性〔10-11〕。課題組通過藥效學(xué)及正交試驗(yàn)考察粉碎粒度、乙醇用量、浸泡時(shí)間、滲漉速度對(duì)茜花制劑提取工藝的影響，確定最佳工藝為：藥材粉碎過五號(hào)篩，加8倍量65%乙醇浸泡24 h，滲漉速度為2 mL/min。該方作為治療痛風(fēng)的經(jīng)驗(yàn)方，用60度以上的高粱酒浸泡而成，療效佳，因此，用65%乙醇提取也與原工藝相符。

建立高尿酸血癥模型是本試驗(yàn)進(jìn)行藥效學(xué)篩選的關(guān)鍵，酵母膏加腺嘌呤致大鼠高尿酸血癥試驗(yàn)需注意大鼠對(duì)酵母膏和腺嘌呤的耐受性，熟練灌胃，避免對(duì)大鼠造成不必要的傷害而導(dǎo)致死亡；靜脈取血避免溶血現(xiàn)象發(fā)生，離心時(shí)應(yīng)盡量取澄清的血清進(jìn)行尿酸檢測，避免出現(xiàn)個(gè)別尿酸值異常偏高。選擇酵母膏加腺嘌呤致大鼠高尿酸血癥模型對(duì)工藝進(jìn)行初步篩選，對(duì)優(yōu)選出的滲漉條件更具科學(xué)意義。