金曉林 高曉芳 張東升

摘要 [目的]考察一種生物防腐劑ProClin 300在小麥、玉米及飼料水提基質(zhì)液中的抑菌效果和對嘔吐毒素（DON）的測定影響。[方法]采用微生物挑戰(zhàn)性試驗驗證ProClin 300對5種指示菌的抑菌能力，同時采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜法（IAC-HPLC）測定水提液中DON的含量。[結(jié)果]不同水提基質(zhì)液中ProClin 300添加量為0.02% ～ 0.10%，分別于（28±1） ℃（霉菌試驗）及（37±1） ℃（細(xì)菌試驗）下放置21 d，7 d后均無菌落生長顯示含0.02%及以上防腐劑對5種指示菌有殺菌作用，且嘔吐毒素含量均未發(fā)生顯著變化（P>0.05）。[結(jié)論]ProClin 300能有效抑菌，對嘔吐毒素檢測無影響，可延長水提樣本液的保存期，有利于縮短陽性樣本的前處理周期。

關(guān)鍵詞 生物防腐劑;嘔吐毒素;提取液;抑菌

Abstract [Objective]The research aimed to investigate the bacteriostatic effect of ProClin 300， a biological preservative， in wheat， corn and feed water extract matrix solution， and its influence on the determination of deoxynivalenol（DON）.[Method] Microbial challenge test was used to verify the bacteriostatic ability of ProClin 300 against five kinds of indicator bacteria， and the content of DON in water extract was determined by high performance liquid chromatographic method with immunoaffinity column cleanup. [Result]The amount of ProClin300 added to different waterextracted matrix solutions was 0.02%-0.10%，and placed at 28±1? ℃ （mould test） and 37±1? ℃ （bacteria test） for 21 days respectively. There was no colony growth on the plate after 7 days，the results showed that the preservative containing 0.02% or more had bactericidal effect on five kinds of indicator bacteria， and the content of DON did not change significantly （P>0.05）.[Conclusion]ProClin 300 can effectively inhibit bacteria， has no effect on the detection of DON， and can prolong the storage period of water extracted sample solution.

Key words Biological preservative;Deoxynivalenol（DON）;Extract;Bacteriostat

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又稱嘔吐毒素，是由小麥赤霉病菌禾谷鐮刀菌復(fù)合群產(chǎn)生一種單端孢霉烯族真菌毒素[1]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）已將DON確定為最危險的自然發(fā)生食品污染物之一[2]，國際癌癥研究中心（IARC）于1993年將其列為三類致癌物[3]。小麥和玉米是我國最大的糧食經(jīng)濟(jì)作物，受氣候的影響極易發(fā)生鐮刀菌的侵染，DON含量是當(dāng)前食品安全、糧食安全及飼料安全風(fēng)險監(jiān)測中最重要的衛(wèi)生指標(biāo)之一。

僅2016年江蘇省小麥粉中DON專項監(jiān)測的樣本數(shù)量達(dá)160份，2018年全國飼料質(zhì)量安全監(jiān)測的各類飼料產(chǎn)品7 424批次，2019年全國政策性糧食庫存數(shù)量和質(zhì)量大清查中，僅江蘇省涉及DON檢測的樣本數(shù)量多達(dá)1 000份[4-6]。面對集中龐大的檢測樣本，通常采用快檢初篩，陽性樣本再經(jīng)高效液相色譜儀確認(rèn)[7]，但繁瑣的二次稱量、提取、離心等工作必不可少，因DON易溶于水，常采用水提取，若不及時冷藏處理，樣本提取液極易發(fā)生腐敗變質(zhì)影響后續(xù)檢測，能否保持水提樣本的基質(zhì)不變化，便于后續(xù)液相分析前的富集凈化，這對于縮短檢測周期具有重要的現(xiàn)實意義。

新一代高效生物防腐劑ProClin，因具有廣譜抗菌性、作用速度快、使用劑量少、pH適用范圍廣（pH 2.0～8.5）、化學(xué)穩(wěn)定性好，毒性遠(yuǎn)低于硫柳汞、疊氮化鈉等同類產(chǎn)品，且與水可以任意比混合等特點，被Supelco公司廣泛應(yīng)用于體外診斷試劑的防腐中[8-9]。ProClin 300主要活性成分是2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮，在與細(xì)胞膜接觸后可滲透到膜內(nèi)抑制胞內(nèi)酶的活性，降低胞內(nèi)能量水平，從而抑制細(xì)菌、真菌和酵母等微生物的生長。為解決生物樣本處理后保存期短的問題，筆者嘗試在小麥、玉米及成品飼料的水提溶液中添加不同濃度的ProClin 300，（28±1）℃、（37±1）℃下放置21 d，考察其抑菌效果和對DON含量測定（免疫親和柱凈化-高效液相色譜法）的影響，評價其在樣本處理液中的防腐能力和對凈化過程中抗原、抗體的結(jié)合影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料。DON標(biāo)準(zhǔn)品[100.7 μg/mL，純度≥98%，GBW（E）100304，溶劑乙腈]，購自國家糧食科學(xué)研究院。ProClin 300，購自上海閃錦分子生物。甲醇、乙腈（色譜純）購自德國Merck公司。其余試劑均為分析純;試驗用水均為超純水。小麥、玉米來源鹽城地方糧食儲備庫。飼料樣本，由江蘇省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心提供。白色念珠菌（CMCC（F）98001）、大腸埃希氏菌（ATCC8739）、金黃色葡萄球菌（CMCC（B）26003）、銅綠假單胞菌（CMCC（B）10104）、黑曲霉（CMCC（F）98003）均購自廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心菌種保藏中心。大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，均購自廣東環(huán)凱微生物科技。沙氏培養(yǎng)基斜面，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.2 儀器。

BCM-1000A生物潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;GHP-9270生化培養(yǎng)箱，上海一恒;T6新悅可見分光光度計，北京普析通用;LC-20AT 液相色譜儀（含SPD-20A紫外檢測器），日本島津;Amethyst C18-H色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美國賽芬;AP-01P型真空泵，天津奧特賽恩斯;無菌溶劑過濾器，美國康寧;934-AH玻璃纖維濾膜（直徑11 cm），英國Whatman;DON免疫親和柱（柱容量≥1 200 ng/支，交叉反應(yīng)：抗DON單抗與DON、15-Ac-DON、3-Ac-DON及NIV的交叉反應(yīng)分別為100%、220%、<0.2%、<0.1%），無錫創(chuàng)譜生物科技提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本處理液的制備。

參照GB 5009.111—2016、GB 4789.15—2016及GB/T 30956—2014[10-12]前處理方法，略有改動。平行稱取粉碎的小麥、玉米及飼料樣本25.0 g各2份于無菌含玻璃珠的三角瓶中，加無菌水225 mL，振蕩器往復(fù)振蕩提取60 min，靜置20 min。上清過0.45 μm無菌濾膜，合并平行濾液，每種樣本分別取20 mL于50 mL無菌離心管中，共3組（細(xì)菌組、霉菌組、DON組），每組設(shè)定不同添加濃度的ProClin 300（0.02%、0.05%、0.10%），4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微生物挑戰(zhàn)性試驗[13]。

1.2.2.1 試驗用菌液的配制。試驗前各取1株標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種到普通斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌所需溫度（37±1）℃，恒溫培養(yǎng)48 h，霉菌所需溫度（28±1）℃，培養(yǎng)6 d，直至產(chǎn)生孢子。用少量的無菌生理鹽水分別將菌苔洗出，充分搖勻，離心，經(jīng)適量無菌水稀釋分別制成109 CFU/mL細(xì)菌懸液（以650 nm對應(yīng)的吸光度0.15時的菌液濃度約108 CFU/mL進(jìn)行推測[14]）以及107 CFU/mL酵母和霉菌懸液（以650 nm對應(yīng)的吸光度1.0時的菌液濃度約107 CFU/mL進(jìn)行推測），混合細(xì)菌量比例采用體積1∶1∶1，霉菌和酵母混合比例也采用體積比1∶1。置4 ℃冰箱冷藏備用，且24 h內(nèi)添加使用。以平板計數(shù)的濃度為橫坐標(biāo)、對應(yīng)650 nm下的吸光度為縱坐標(biāo)，考察混合菌懸液的線性關(guān)系。

1.2.2.2 挑戰(zhàn)試驗。細(xì)菌組中加入0.2 mL細(xì)菌混懸液，霉菌組加入0.2 mL的霉菌和酵母孢子混懸液，使得受檢樣本最終含菌量分別達(dá)107、105 CFU/mL，充分混勻。分別將樣品置于（37±1） ℃（細(xì)菌培養(yǎng)）及（28±1） ℃（霉菌及酵母）條件下，在接菌后0、7、14、21 d取樣進(jìn)行分析，每次取1.0 mL進(jìn)行平板計數(shù)，以微生物濃度的對數(shù)值進(jìn)行記錄。

1.2.3 DON高效液相色譜測定。

取樣時間同“1.2.2”，取DON組樣本3 mL，PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）稀釋至30 mL，過玻璃纖維濾紙，取20 mL過免疫親和柱凈化，凈化過程如GB 5009.111—2016及GB/T 30956—2014所描述。2.0 mL色譜純甲醇洗脫，氮氣揮干，1 mL流動相復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)相濾膜后HPLC測定。色譜條件：Amethyst C18-H柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），島津SPD-20A紫外檢測器，檢測波長220 nm，流動相乙腈-水（16∶84），等度洗脫，流速1.0 mL/min;柱溫箱35 ℃，進(jìn)樣體積20 μL。

1.3 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 16.0軟件，所有數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，數(shù)據(jù)對比采取新復(fù)極差分析，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，不同小寫字母具有顯著性差異（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌吸光度與菌液濃度的線性關(guān)系

從圖1a可以看出，3種致病菌菌懸液的混合，濃度在0.13×109～0.84×109 CFU/mL時，吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系，且1.0×108 CFU/mL的混懸液對應(yīng)的吸光度在0.29，這與董自艷等[14]的研究報道基本一致。由于霉菌與酵母的個體直徑遠(yuǎn)大于細(xì)菌，相同濃度下，其吸光度要高于細(xì)菌，由圖1b可以發(fā)現(xiàn)在0.02×107～0.20×107 CFU/mL吸光度與濃度決定系數(shù)R2達(dá)0.998 2。

2.2 不同防腐劑量對細(xì)菌及霉菌挑戰(zhàn)性試驗

從表1的抑菌效果來說，ProClin 300對于霉菌及細(xì)菌的抑制效果非常好，7 d后不同濃度的添加均無菌落生長（細(xì)菌的稀釋度為0.1和0.01，霉菌為原液），展示了低劑量具有較強(qiáng)的殺菌能力。小麥及玉米為農(nóng)產(chǎn)品，收儲過程未對帶菌量進(jìn)行限量要求，飼料的生產(chǎn)過程包括熱殺菌過程，但是飼料的水提液營養(yǎng)極為豐富，雖然初始濃度較低，若不添加防腐劑，極容易腐敗變質(zhì)。從飼料衛(wèi)生指標(biāo)[15]中可知，飼料原料的細(xì)菌限量要求小于2×106 CFU/g，霉菌限量要求小于4×104 CFU/g。試驗的添加濃度換算成固體濃度略高于限量值。

按照化妝品、盥洗用品與香料協(xié)會（CTFA）標(biāo)準(zhǔn)要求[16]，在第7天時，細(xì)菌及霉菌數(shù)分別下降99.9%、90.0%，且28 d內(nèi)呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢，則防腐效果優(yōu)良。該試驗結(jié)果顯示，ProClin 300添加量≥0.02%時，7 d后細(xì)菌、霉菌對數(shù)值分別下降至1和0，通過了挑戰(zhàn)試驗。對比林竹[17]的研究報道，其固體化妝品細(xì)菌和霉菌混合試驗菌添加濃度分別為106、105 CFU/g，優(yōu)選的防腐體系苯氧乙醇（0.5%）與甲基異噻唑啉酮（0.06%）的結(jié)果顯示7 d細(xì)菌對數(shù)值下降了2，霉菌對數(shù)值下降了4; 從固體換算至液體中的防腐劑濃度在0.050%和0.006%，抑制效果的差異主要受復(fù)合的防腐體系及濃度影響。

2.3 不同防腐劑量下DON含量檢測

在不添加防腐劑的空白對照組，研究人員發(fā)現(xiàn)，水提液在24 h后，已經(jīng)發(fā)生腐敗變質(zhì)，48 h后溶液的pH達(dá)4.5～5.0，為防止酸性溶液影響抗原抗體的結(jié)合，采用PBS緩沖溶液進(jìn)行稀釋后過免疫親和柱，保證抗原抗體的結(jié)合。對不同樣本第21天添加不同防腐劑量下的DON含量（表2）進(jìn)行方差分析，發(fā)現(xiàn)F（27.86）>F0.05（2.30），表明不同防腐劑量間無顯著差異。圖2則說明在不同樣本的水提液中，未添加防腐劑的空白對照和添加防腐劑在連續(xù)21 d下的DON含量無顯著差異（P>0.05）。但腐敗變質(zhì)的氣味會無法使分析人員愉悅地進(jìn)行工作。

3 討論與結(jié)論

評價一種生物防腐劑的效力通常需篩選最適pH和初始菌量。吳慧清等[18]研究報道在pH 6.0以下及起始菌懸液濃度均低的情況下，殼聚糖復(fù)合生物防腐劑對于5種指示菌抑菌的效果最好，但考慮到樣本后期免疫親和柱的凈化，需磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L PBS，pH 7.4）稀釋至pH 7～8，以保證抗體有效捕獲提取液中的DON，即使按照5倍稀釋來說，凈化2 mL的原液實際上過柱體積為10 mL，如此將延長凈化處理的時間。對于防腐劑的添加量理應(yīng)隨初始帶菌量的增加而增加，為保證ProClin 300添加濃度的適用性，研究人員進(jìn)行了50份小麥、20份玉米及30份仔豬配合飼料的初始菌落總數(shù)、霉菌和酵母測定發(fā)現(xiàn)，原始樣本菌落總數(shù)均小于105 CFU/mL，霉菌和酵母含量均小于105 CFU/mL，與狄元冉等[19]、高延玲等[20]報道生物飼料添加劑及飼料中致病微生物的污染水平基本一致。

從免疫親和凈化原理[21]來看，水提液中的DON通過層析柱，與固定在瓊脂糖凝膠上的單抗發(fā)生抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，淋洗環(huán)節(jié)可有效地去除包括防腐劑在內(nèi)的雜質(zhì)。已有研究報道[22-23]，ProClin 不會對診斷試劑中的關(guān)鍵酶如辣根過氧化物酶（HRP）及堿性磷酸酶（AP）與底物的結(jié)合產(chǎn)生影響，研究人員在對比含DON的PBS溶液（添加ProClin 300至0.5%，對照組ProClin 300濃度0），過免疫親和柱凈化-液相測定后發(fā)現(xiàn)，相同濃度峰面積差異<5%，再次表明高濃度ProClin 300存在下對于抗DON抗體與抗原的結(jié)合反應(yīng)沒有影響。

該試驗結(jié)果表明，添加≥0.02% ProClin 300的水提基質(zhì)液可常溫放置21 d，為陽性樣本后續(xù)過免疫親和柱凈化，減少了繁瑣的稱量、提取、離心等前處理過程。添加了ProClin 300的樣本提取液冷藏狀態(tài)下存儲時間更長，但氧化帶來的風(fēng)險仍需關(guān)注。另外，對于其他霉菌毒素的提取液（一定濃度的甲醇或乙腈溶液）是否有作用，還需進(jìn)一步的探索。

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