江馳航 胡子文 王智誠

摘要 由于形態(tài)學(xué)無法更精準(zhǔn)地鑒別部分紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀，因此需要通過分子手段鑒別此類無法直觀辨認(rèn)的東方鲀。該研究以15尾紅鰭東方鲀和30尾暗紋東方鲀?yōu)椴牧?，使用NCBI上紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀的線粒體全基因組中3個基因COⅠ、COⅡ、COⅢ保守區(qū)域通過Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計。將45個樣品在摸索得到的最適條件下進(jìn)行擴(kuò)增并測序，對測序結(jié)果進(jìn)行檢驗，分析種間差異并進(jìn)行堿基組成性分析，得出COⅠ上有9個SNPs，COⅡ上有4個SNPs，COⅢ有10個SNPs，使用MEGA-X進(jìn)行進(jìn)化樹分析得出，該研究所設(shè)計的引物可以有效地鑒別2種東方鲀。

關(guān)鍵詞 紅鰭東方鲀;暗紋東方鲀;種質(zhì)鑒定;分子標(biāo)記

Abstract Because morphology cannot identify some Takifugu rubripes and Takifugu obscurus more accurately，molecular means must be used to identify such invisible Takifugu.In this study，15 T.rubripes and 30 T.obscurus were used. Three genes COⅠ，COⅡ，and COⅢ in the entire mitochondrial genome of T.rubripes and T.obscurus on NCBI were performed by Primer5.0 designed for primer design.Fortyfive samples were amplified and sequenced under the optimal conditions，and the sequencing results were checked. The differences between species were analyzed and base composition analysis was performed. It was found that there were 9 SNPs on COⅠ，4 SNPs on COⅡ and 10 SNPs on COⅢ. Using MEGA-X to analyze the phylogenetic tree，we can conclude that the primers designed in this study can effectively identify two Takifugu species.

Key words Takifugu rubripes;Takifugu obscurus;Germplasm identification;Molecular marker

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）俗稱黑蠟頭、虎河豚，與暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）均屬于鲀形目（Tetraodontiformes）、鲀科（Tetraodontidae）、東方鲀屬（Takifugu），在我國分布于黃海、渤海、東海，是我國比較重要的幾種經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類之一，其味道鮮美，肉質(zhì)細(xì)膩，魚皮富含膠原蛋白，魚肉蛋白質(zhì)含量極高，而且其中所含有的河豚毒素也具有很高的價值，已在中國、日本以及韓國等亞洲國家廣泛培育[1-2]。

通過動物形態(tài)學(xué)去鑒別物種，是物種鑒別常見也是最基礎(chǔ)的方法，具有簡單直觀等優(yōu)點。生物學(xué)具有悠久發(fā)展歷史，自動物解剖開始，到動物形態(tài)學(xué)，再到宏觀形態(tài)學(xué)研究，目前已發(fā)展成為包括解剖學(xué)、比較解剖學(xué)、細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)、古動物學(xué)和胚胎學(xué)等的綜合性學(xué)科[3]。形態(tài)學(xué)方法可概括為可數(shù)性狀、可量性狀、結(jié)構(gòu)特征等[4] 。但因為其判斷的主觀性強，需要比較專業(yè)的系統(tǒng)學(xué)知識，而且由于不同發(fā)育階段的形態(tài)學(xué)和地理隔絕也存在著差異，容易導(dǎo)致判斷的錯誤，因此需要更精確的鑒定方式去鑒別形態(tài)學(xué)中無法辨認(rèn)的隱形種。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種應(yīng)用分子生物學(xué)將目的DNA片段在生物體外放大擴(kuò)增的一項技術(shù)，其利用DNA在高溫時破壞氫鍵變性成單鏈，降溫時復(fù)性使引物（能與目的基因互補配對的寡核苷酸片段）與目的基因單鏈結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度72 ℃，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖（5′—3′）的方向合成互補鏈[5]。通過對不同物種基因的保守區(qū)段設(shè)計引物，可應(yīng)用該技術(shù)獲得多個物種的同一基因的類似片段，比較這些基因片段的差異程度可判斷這些物種的親緣關(guān)系及區(qū)別鑒定這些物種。線粒體DNA（mtDNA）是一種在進(jìn)化過程中替換率比DNA的高5～10倍并廣泛存在于生物體內(nèi)的遺傳物質(zhì)，已經(jīng)被廣泛利用于動植物的種群遺傳學(xué)研究[6-7]，其中COⅠ基因是細(xì)胞色素氧化酶3個亞基基因中的一個相當(dāng)保守的蛋白質(zhì)編碼基因，基因組中很少存在插入和缺失，其普遍替代速率為0.016 8～0.023 0每個位點/每百萬年[8-9]，長為658 bp左右的十分適合解析親緣關(guān)系相近的分類類群[10]。國內(nèi)外已經(jīng)有研究者通過此段序列對未知物種進(jìn)行系統(tǒng)的分類，并且打破傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的物種分類[11-12]，COⅡ與COⅢ同樣存在于mtDNA中，其組成也是十分保守。

SNP是單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphism），屬于第三代分子標(biāo)記技術(shù)，是在基因組水平上的單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，具有可以穩(wěn)定遺傳的優(yōu)點，故此通過查找在不同物種間存在的SNP能有效地將這些物種加以區(qū)分，同樣當(dāng)某一物種的不同性狀出現(xiàn)SNP時，則可以利用對SNP的篩選進(jìn)行育種。 該方法已有應(yīng)用的先例，Lin等[13]利用 SNP 成功建立了大黃魚有效的鑒定遺傳性別的方法。

該研究使用多條紅鰭東方鲀與暗紋東方鲀，通過查找在兩種群間有差異而在群體中無差異的SNP作為鑒定兩種群差異的分子標(biāo)記。通過設(shè)計引物在PCR反應(yīng)中將這些存在于遺傳信息中的差異放大，借助測序技術(shù)及生物分析篩出這些可作為分子標(biāo)記的SNP。檢測這些SNP可鑒別這兩群體間難以通過形態(tài)學(xué)鑒定個體，可應(yīng)用于養(yǎng)殖育種、食品檢疫、生態(tài)環(huán)保等領(lǐng)域。

2.4 2種東方鲀基因進(jìn)化樹分析

使用MEGA-X中的鄰接法（NJ）模型，使用其測序修剪長度的DNA片段構(gòu)建所有個體的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5～7），檢驗方法使用Bootstrap method重復(fù) 1 000次。在3個基因的進(jìn)化樹中紅鰭東方鲀15個個體（圖中編號為31～45）和暗紋東方鲀30個個體（圖中編號為1～30）分別聚為一支，說明所設(shè)計的這3對基因引物的擴(kuò)增產(chǎn)物能有效地區(qū)分紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀。

3 討論

近些年來，分子標(biāo)記在水產(chǎn)動物遺傳育種中的應(yīng)用越來越廣泛。SNP具有普遍性、穩(wěn)定性且檢測十分簡便，而且部分特殊SNP可以直接影響生物本身的性狀，SNPs也會根據(jù)地理環(huán)境的不同具有不同的性狀特點[14]。

該研究以45個紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀肌肉組織為材料，在COⅠ中篩選出了9個種間特異性SNPs，均為同義突變;在COⅡ中篩選出了4個種間特異性SNPs，其中A371G發(fā)生了錯義突變，紅鰭東方鲀密碼子為GTC即纈氨酸，暗紋東方鲀?yōu)锳TC即異亮氨酸，均位于線粒體內(nèi)膜外。在暗紋東方鲀COⅡ中的第385位發(fā)生了錯義突變，密碼子由ACC突變?yōu)镚CC，氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)楸彼?，均位于線粒體內(nèi)膜外。

在COⅢ中篩選出了10個種間特異性SNPs，其中T310G發(fā)生了錯義突變，紅鰭東方鲀密碼子為GCA即丙氨酸，暗紋東方鲀?yōu)門CA即絲氨酸，位置在非跨膜區(qū)。

這些篩選出的23個SNPs可作為鑒別2種東方鲀的分子標(biāo)記，并且等位基因數(shù)是反映某一位點在進(jìn)化過程中所積累遺傳變異程度的重要指標(biāo)。等位基因數(shù)越高表明此位點在進(jìn)化歷史上的突變越活躍，該物種有多種方式適應(yīng)自然選擇，對復(fù)雜生存環(huán)境的適應(yīng)力也越強[15-16]。紅鰭東方鲀?nèi)后w數(shù)少但是 變異位點數(shù)更多，說明紅鰭東方鲀所處環(huán)境更復(fù)雜。

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