叢 彬， 楊 俊， 王 慧， 劉伯承， 周望平， 傅勝才

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)也稱“金葡菌”，是革蘭氏陽性球菌，常寄居與人和動(dòng)物的皮膚、鼻咽喉、腸胃道、癰、以及化膿瘡口中，也存在于空氣、污水等環(huán)境中，是一種常見的食源性致病微生物[1]。金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要傳染性致病菌之一，金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的奶牛乳房炎治愈率低、復(fù)發(fā)率高，常引起奶牛產(chǎn)奶量下降、奶質(zhì)量下降、廢棄奶和病死牛的數(shù)量增加，給奶牛生產(chǎn)業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，臨床上奶牛乳房炎的主要預(yù)防和治療措施為抗生素乳房灌注[3]。但是，該菌株可以通過自身表型改變以及調(diào)節(jié)代謝通路對(duì)抗生素產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥，同時(shí)還可以通過水平等方式轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因從而對(duì)各種抗生素產(chǎn)生耐藥性[4]，使抗生素的臨床治療效果大打折扣。2000年以來，隨著在獸醫(yī)臨床上各種抗生素的廣泛使用和不規(guī)范應(yīng)用，使包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的各種細(xì)菌耐藥菌株的種類及數(shù)量越來越多，呈現(xiàn)出耐藥范圍廣、多重耐藥、耐藥率高的特點(diǎn)，給臨床治療奶牛乳房炎帶來極大阻礙[5]，因此，對(duì)于金黃色葡萄球菌耐藥性研究引起人們廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)查湖南省部分地區(qū)奶牛場(chǎng)金黃色葡萄球菌耐藥性情況，檢測(cè)耐藥基因種類，可為金黃色葡萄球菌的感染提供治療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

19株奶牛金黃色葡萄球菌(分別編號(hào)1～19)均從湖南省多個(gè)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)分離得到，將得到的所有菌株一起進(jìn)行鑒定培養(yǎng)和耐藥基因檢測(cè)。

1.2 主要藥品和試劑盒

15種藥敏試紙及規(guī)格：青霉素(RA)，10 μg/片；苯唑西林(OX)，10 μg/片；氧氟沙星(OFX)，30 μg/片；頭孢唑林(KZ)，15 μg/片；萬古霉素(VA)，30 μg/片；克林霉素(DA)，30 μg/片；恩諾沙星(ENR)，100 μg/片；氨芐西林(AMP)，10 μg/片；環(huán)丙沙星(CIP)，5 μg/片；四環(huán)素(TCY)，30 μg/片；慶大霉素(CN)，10 μg/片；紅霉素(ERY)，15 μg/片；氯霉素(C)，10 μg/片；甲氧芐啶(W)，30 μg/片；利福平(RD)，30 μg/片。所有藥敏試紙均購自杭州微生物試劑有限公司(表1)。

1.3 主要儀器

津騰針式過濾除菌器購自北京開源國(guó)創(chuàng)科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器購自上海申安醫(yī)療器械廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MJP型恒溫培養(yǎng)箱購自北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器購自上海智城分析儀器制造有限公司；DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠；Tanon3500R型凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司。

表1 主要藥品及來源

1.4 培養(yǎng)基制備

BP培養(yǎng)基的配制：加入蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀0.75 g，磷酸二氫鈉4.5 g，氯化鈉2.5 g，蒸餾水500 mL，121 ℃高壓滅菌15 min，用無菌燒瓶分裝。

1.5 奶牛源金黃色葡萄球菌的分離

從湖南省多個(gè)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)采集78份樣品：用手按摩奶牛乳房，使其有牛奶流出，棄去前3把奶，將采樣管插入奶牛乳房，取牛奶乳樣10 mL，密封寫好編號(hào)，低溫保存，盡快送至實(shí)驗(yàn)室。

用無菌棉拭子在血平板瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37 ℃下培養(yǎng)18 h，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落接種至BP培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)24 h，挑取在培養(yǎng)基上顯示特殊光圈的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，而后鏡檢。挑取菌落在血平板培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.6 革蘭氏染色

在高溫滅菌后的干燥載玻片上滴加1滴生理鹽水，用滅菌接種環(huán)挑取少量單個(gè)菌落，與生理鹽水混合后均勻涂抹于載玻片上，載玻片反面用酒精燈灼燒以固定，不可時(shí)間過長(zhǎng)，在固定的細(xì)菌上滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，染色1 min后水洗；在菌膜上滴加碘液，作用1 min后水洗；滴加95%酒精脫色15～30 s，水洗；滴加復(fù)紅復(fù)染1 min，水洗；自然干燥或用紙吸干后在顯微鏡下用油鏡觀察。

1.7 酶觸實(shí)驗(yàn)

在無菌干燥的載玻片上滴加1滴3%的過氧化氫，用無菌棉簽挑取純化細(xì)菌滴入過氧化氫溶液中觀察其變化。30 s內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡，則判定為陽性，不產(chǎn)生氣泡則判定為陰性。

1.8 血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)

向3個(gè)無菌EP管中加入1∶4的新鮮兔血漿0.5 mL，管1加入培養(yǎng)24 h的疑似菌株肉湯培養(yǎng)基0.5 mL，管2加入培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌指控菌株肉湯培養(yǎng)基0.5 mL，管3加入滅菌肉湯培養(yǎng)基0.5 mL作為對(duì)照。將3只EP管搖勻，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔30 min觀察1次，觀察6 h，檢查是否有凝固出現(xiàn)，將試管傾斜或倒置，呈現(xiàn)凝固狀，則判定為陽性；無凝固現(xiàn)象產(chǎn)生，則判定為陰性。

參芪地黃湯加減治療慢性腎小球腎炎的Meta分析及試驗(yàn)序貫分析 ………………………………………… 梁家華等（12）：1697

1.9 16S rRNA鑒定

16S rRNA引物為通用引物27F和1492R，引物序列(5′-3′)分別為：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和GGTTACCTTGTTACGACTT。

反應(yīng)體系與條件：按照Mix說明書，32 μL反應(yīng)體系：

Mix上游引物下游引物DNA模板ddH2O10 μL1 μL 1 μL 2 μL 18 μL 94 ℃預(yù)變性94 ℃變性59 ℃退火 72 ℃延伸72 ℃再延伸5 min 1 min1 min2 min10 minüty??????30個(gè)循環(huán)

16S rRNA基因測(cè)序：上述PCR產(chǎn)物由六合華大生物有限公司測(cè)序，序列與Blast序列比對(duì)。

1.10 藥敏試驗(yàn)

參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的紙片瓊脂擴(kuò)散法(kirby-bauer，K-B)進(jìn)行，將金黃色葡萄球菌在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用麥?zhǔn)媳葷峁軐?duì)照濃度，稀釋濃度至1.5×108cfu/mL后(約0.5麥?zhǔn)蠞舛?，取100 μL于血平板培養(yǎng)基上后涂布均勻靜置5 min，用無菌鑷子將5片圓形藥敏試紙等距貼在血平板培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)16～18 h，用直尺測(cè)量各藥敏試紙片抑菌圈直徑大小并記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果判定：以CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，分為耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)3種，每株菌株的藥敏試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，抑菌圈大小取3次試驗(yàn)的平均值后判定耐藥結(jié)果。

1.11 耐藥基因檢測(cè)

使用PCR技術(shù)檢測(cè)分離出的金黃色葡萄球進(jìn)行耐藥基因，耐藥基因序列如表2。

表2 耐藥基因引物序列

反應(yīng)體系與條件：按照Mix說明書，32 μL反應(yīng)體系：

Mix上游引物下游引物DNA模板ddH2O10 μL1 μL 1 μL 2 μL 18 μL 94 ℃預(yù)變性94 ℃變性58 ℃退火 72 ℃延伸72 ℃再延伸5 min 30 s30 s45 s7 minüty??????30個(gè)循環(huán)

2 結(jié)果及分析

2.1 金黃色葡萄球菌革蘭氏染色鑒定

革蘭氏染色鑒定結(jié)果如圖1所示，顯示所鑒定菌株為革蘭氏陽性菌，并顯示為符合葡萄球菌的菌體形態(tài)。

圖1 革蘭氏染色后呈紫色葡萄狀

2.2 金黃色葡萄球菌酶觸試驗(yàn)結(jié)果

酶觸試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，顯示所鑒定菌株為革蘭氏陽性球菌。

圖2 酶觸反應(yīng)30 s內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡

2.3 血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)

血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，顯示所鑒定菌株為葡萄球菌，血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)管1和2凝固，對(duì)照組管3無凝固現(xiàn)象。

圖3 血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 金黃色葡萄球菌16S rRNA鑒定

16S rRNA鑒定顯示結(jié)果如圖4所示，所有被鑒定菌株均為金黃色葡萄球菌，序列與Genebank金黃色葡萄球菌序列比對(duì)相似度均大于99%。

注：M為Marker；1為陰性對(duì)照；2為陽性對(duì)照；3～21為樣品。

圖419株金黃色葡萄球菌16SrRNA鑒定結(jié)果

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果及多重耐藥分析

藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，所選菌株對(duì)所有抗生素均表現(xiàn)出S、I和R 3種不同的敏感程度。耐藥譜結(jié)果見表4顯示。

表3 19株金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：R表示耐藥，I表示中介，S表示敏感。

表4 19株金黃色葡萄球菌耐藥譜

某種抗生素的耐藥率定義為對(duì)此種抗生素耐藥的菌株數(shù)占試驗(yàn)菌株總數(shù)的比率，進(jìn)一步對(duì)菌株耐藥率進(jìn)行探索分析，19株金黃色葡萄球菌對(duì)15種抗生素的耐藥率各不相同，其中對(duì)青霉素的耐藥率達(dá)到89.5%，對(duì)紅霉素、慶大霉素均大于50%，對(duì)萬古霉素較為敏感，未發(fā)現(xiàn)有耐利福平的菌株(圖5)。

2.6 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)金黃色葡萄球菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果如圖6。

圖5 19株金黃色葡萄球菌耐藥率

5號(hào)耐藥基因9號(hào)耐藥基因

12號(hào)耐藥基因 16號(hào)耐藥基因

注：M為DNA marker；數(shù)字1為fexA；數(shù)字2為aac(6′)/aph(2″)；數(shù)字3為tetA；數(shù)字4為Nuc。

圖6金黃色葡萄球菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

在本次試驗(yàn)中，共采集了湖南省多地78份樣品，檢測(cè)到金黃色葡萄球菌19株，檢出率為24.35%，趙效南等[6]在檢測(cè)山東省400多份牛乳樣品中，金黃色葡萄球菌的檢出率為35.8%，分離率明顯高于本試驗(yàn)。劉保光等[7]對(duì)河南省350份牛奶樣品中，分離到80余株金黃色葡萄球菌，分離率達(dá)到22.86%，與本試驗(yàn)的分離率接近；王登峰等人[5]在采集的6個(gè)省市1 069份奶樣中，分離了金黃色葡萄球菌219株，分離率為20.49%，提示各地區(qū)的感染情況可能有所差異。19株金黃色葡萄球菌對(duì)抗生素的耐藥情況各不相同，所有細(xì)菌均呈現(xiàn)多重耐藥，最低為2耐，最高為8耐，3株金黃色葡萄球菌對(duì)8種抗生素耐藥。其中，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素青霉素的耐藥率為89.3%，這與杜琳等[8]檢測(cè)5個(gè)省市金黃色葡萄球菌提到的青霉素80%的耐藥率保持一致。對(duì)紅霉素和慶大霉素的耐藥率大于50%。對(duì)萬古霉素普遍敏感，萬古霉素是特殊耐藥抗生素，對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌有效[9]，但只有經(jīng)過嚴(yán)格的審核程序后才可使用，這與OSMAN等[10]在調(diào)查埃及牛奶樣品的耐藥性試驗(yàn)中，對(duì)萬古霉素的耐藥率為9.5%情況相同。未發(fā)現(xiàn)有耐利福平的菌株，可將萬古霉素與利福平聯(lián)合用藥治療金黃色葡萄球菌感染。耐藥情況不同提示可能與各地區(qū)用藥習(xí)慣有關(guān)，由于動(dòng)物飼料中抗菌藥物的過度使用，存在多重抗藥性(MDR)病原體正日益成為目前較嚴(yán)重的問題[11]。這也提醒養(yǎng)殖人員應(yīng)合理選擇用藥，加強(qiáng)對(duì)環(huán)境的管理，并繼續(xù)對(duì)動(dòng)物源細(xì)菌耐藥進(jìn)行監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步防止動(dòng)物源耐藥細(xì)菌傳播至人類。

試驗(yàn)共檢測(cè)了4種耐藥基因，分別為四環(huán)素耐藥基因TetA、氨基糖苷類耐藥基因aac(6′)/aph(2″)、喹諾酮類耐藥相關(guān)基因Nuc、氯霉素類抗菌耐藥基因fexA[12]。4株所選菌株均具有氯霉素類抗菌耐藥基因fexA，與藥敏試驗(yàn)的結(jié)果一致。細(xì)菌的耐藥機(jī)智形成原因眾多，如藥物捕獲、酶失活和主動(dòng)外排系統(tǒng)等，最重要的機(jī)制細(xì)菌運(yùn)用主動(dòng)外排系統(tǒng)，將藥物通過外排泵對(duì)抗抗生素，金黃色葡萄球菌的外排系統(tǒng)主要包括NorA、NorB、NorC、MsrA、MepA等[13]。在篩選氯霉素耐藥基因fexA的預(yù)試驗(yàn)中，fexA的檢出率低于抗氯霉素藥敏試驗(yàn)的檢出率，這可能是由于耐藥基因并非唯一決定細(xì)菌耐藥性原因。

要做到正確防治金黃色葡萄球菌，避免奶牛乳房炎所造成的損失，首先應(yīng)該正確使用抗生素，避免濫用、錯(cuò)用；其次，奶牛場(chǎng)應(yīng)建立健全的消毒規(guī)范，從源頭防治；最后，在治療方面，中藥對(duì)于金黃色葡萄球菌的治療也有相關(guān)報(bào)道，王雙雙等[14]研究了黃連等5種中藥對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用，對(duì)這方面可以進(jìn)行深入研究。