陳杰

湖南省腫瘤醫(yī)院，長沙 410000

結(jié)直腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，常發(fā)生在直腸和乙狀結(jié)腸交界處，發(fā)病率在人體惡性腫瘤中居第三位[1]。結(jié)直腸癌起病隱匿，易轉(zhuǎn)移，預后較差，病死率較高。因此，探討發(fā)病機制結(jié)直腸癌對早期診斷、個體化治療、提高治療效果、改善患者生存和預后具有重要意義。微小RNA(miRNA)作為一種內(nèi)源性RNA，其通過靶向mRNA在轉(zhuǎn)錄后水平進行翻譯抑制或降解調(diào)節(jié)基因表達，調(diào)節(jié)細胞生長、分化、增殖和凋亡[2]。多項研究[3～5]表明，miRNA可作為抑癌基因或癌基因發(fā)揮作用，參與包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、進展和耐藥等生物學過程。微小RNA-20a-5p(miR-20a-5p)是一種常見的miRNA，其在結(jié)直腸癌中表達上調(diào)，并發(fā)揮致癌基因的功能[6,7]。然而，miR-20a-5p在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的生物學作用和確切機制仍不清楚。生物信息學分析顯示，乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因1(BRMS1L)是miR-20a-5p的潛在功能性靶基因之一，BRMS1L是一種新的抑癌基因，在卵巢癌和乳腺癌中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可抑制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8,9]。然而，miR-20a-5p靶向BRMS1L是否參與結(jié)腸癌進展尚未可知。本研究觀察了miR-20a-5p靶向調(diào)控BRMS1L對人結(jié)直腸癌細胞株SW480增殖、凋亡能力的影響，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株、轉(zhuǎn)染物及主要試劑 人結(jié)直腸癌細胞株SW480、DLD-1、HCT116及正常結(jié)直腸黏膜細胞株FHC購自中國科學院上海細胞庫。miR-20a-5p抑制物(anti-miR-20a-5p)、miR-20a-5p抑制物陰性對照(anti-miR-NC)、BRMS1L過表達載體(pcDNA-BRMS1L)、BRMS1L過表達載體陰性對照(pcDNA-NC)、miR-20a-5p模擬物(miR-20a-5p mimics)、miR-20a-5p模擬物陰性對照(miR-NC)及BRMS1L小干擾RNA陰性對照(si-NC)、BRMS1L小干擾RNA(si-BRMS1L)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；含有miR-20a-5p結(jié)合位點的BRMS1L-3′UTR野生型(WT-BRMS1L)及突變型(MUT-BRMS1L)報告基因載體的構(gòu)建由南京諾唯贊生物科技公司提供。DMEM-12、DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司；LipofectamineTM2000購自美國Thermo公司；TRIzol試劑、細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)、膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技公司；兔抗BRMS1L、細胞周期素D1(CyclinD1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-Caspase-3)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體購自美國Abcam公司；山羊抗兔Ⅱ抗購于上海碧云天公司。

1.2 結(jié)腸癌細胞株的選擇 采用qRT-PCR法和Western blotting法檢測FHC、SW480、DLD-1、HCT116細胞中miR-20a-5p mRNA和BRMS1L mRNA、蛋白。FHC、SW480、DLD-1、HCT116細胞中miR-20a-5p mRNA分別為1.00±0.10、3.22±0.32、3.01±0.30、2.35±0.24，BRMS1L mRNA分別為1.02±0.11、0.35±0.04、0.44±0.05、0.30±0.03，BRMS1L蛋白分別為1.04±0.12、0.33±0.03、0.42±0.04、0.45±0.05，SW480、DLD-1、HCT116細胞與FHC細胞比較，P均<0.05。SW480與FHC細胞比較差異最為顯著，根據(jù)以上結(jié)果，選擇SW480細胞作為本研究的實驗細胞。

1.3 SW480細胞anti-miR-20a-5p、pcDNA-BRMS1L轉(zhuǎn)染 取SW480細胞，將細胞接種到6孔板，當細胞密度達到60%時利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000進行轉(zhuǎn)染，A、B、C、D、E、F組分別轉(zhuǎn)染anti-miR-20a-5p、anti-miR-NC、pcDNA-BRMS1L、pcDNA-NC、anti-miR-20a-5p+si-BRMS1L、anti-miR-20a-5p+si-NC，6 h后換液，轉(zhuǎn)染48 h，轉(zhuǎn)染合格后，取上述各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 轉(zhuǎn)染anti-miR-20a-5p、pcDNA-BRMS1L的SW480細胞增殖能力觀察 ①存活率：采用CCK-8法。將A、B、C、D、E、F組SW480細胞按照每孔3 000接種96孔板，培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱孵育2 h。檢測450 nm的吸光度值(A值)，以空白孔調(diào)零，結(jié)果以細胞存活率表示，細胞存活率=(對照組A值/實驗組A值)×100%。②CyclinD1蛋白：采用Western blotting法。將A、B、C、D、E、F組SW480細胞接種到6孔板，細胞密度為80%時，采用Western blotting法檢測細胞中CyclinD1蛋白。CyclinD1蛋白相對表達量=CyclinD1灰度值/β-actin灰度值。

1.5 轉(zhuǎn)染anti-miR-20a-5p、pcDNA-BRMS1L的SW480細胞凋亡能力觀察 ①凋亡率：采用Annexin V-FITC/PI雙染法。將A、B、C、D、E、F組SW480細胞接種到6孔板，細胞密度為80%時，用胰蛋白酶消化各組細胞，離心收集細胞沉淀，添加500 μL的結(jié)合緩沖液，加入Annexin V-FITC和PI染液各5 μL，用流式細胞儀檢測細胞凋亡變化，結(jié)果以細胞凋亡率表示。②Cleaved-Caspase-3蛋白：檢測方法參照“1.4”中CyclinD1蛋白的檢測方法。

1.6 轉(zhuǎn)染anti-miR-20a-5p、pcDNA-BRMS1L的SW480細胞β-catenin蛋白檢測 檢測方法參照“1.4”中CyclinD1蛋白的檢測方法。

1.7 miR-20a-5p與BRMS1L之間靶向關(guān)系、調(diào)控作用驗證 ①靶向關(guān)系：采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?。將miR-20a-5p mimics、miR-NC分別與WT-BRMS1L或MUT-BRMS1L共轉(zhuǎn)染至SW480細胞(分別記為G、H組)，轉(zhuǎn)染48 h，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測兩組細胞熒光素酶活性。②調(diào)控作用：采用Western blotting法。將SW480細胞接種到6孔板，當細胞密度達到60%時，將miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p、anti-miR-NC分別轉(zhuǎn)染SW480細胞(分別記為I、J、K、L組)，48 h后采用Western blotting法檢測BRMS1L蛋白。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞存活率、凋亡率及CyclinD1、Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量比較 細胞存活率、凋亡率及CyclinD1、Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量比較見表1。

表1 各組細胞存活率、凋亡率及CyclinD1、Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量比較

注：與B組比較，*P<0.05；與D組比較，△P<0.05；與F組比較，﹟P<0.05。

2.2 各組β-catenin蛋白相對表達量比較 A、B、C、D、E、F組β-catenin蛋白相對表達量分別為0.36±0.04、0.72±0.07、0.42±0.03、0.70±0.06、0.60±0.06、0.34±0.03，anti-miR-20a-5p組、anti-miR-NC組比較，pcDNA-BRMS1L組、pcDNA-NC組比較，anti-miR-20a-5p+si-BRMS1L組、anti-miR-20a-5p+si-NC組比較，P均<0.05。

2.3 各組細胞熒光素酶活性及BRMS1L蛋白相對表達量比較 兩組細胞熒光素酶活性比較見表2。I、J、K、L組BRMS1L蛋白相對表達量分別為0.12±0.01、0.36±0.04、0.82±0.08、0.38±0.05，I、J組比較，K、L組比較，P均<0.05。

表2 兩組細胞WT-BRMS1L、MUT-BRMS1L相對熒光素酶活性比較

注：與H組比較，*P<0.05。

3 討論

結(jié)直腸癌又叫大腸癌，是指大腸上皮來源的癌癥，好發(fā)于40歲以上的中老年人，且男性多于女性，多數(shù)患者后期可出現(xiàn)大便性狀改變、便血和腹痛。雖然外科手術(shù)治療、術(shù)后放化療、靶向治療等綜合治療手段不斷改善，但每年全球新增結(jié)腸癌患者高達100萬例，且死亡人數(shù)超過69萬例[1]，是亟待解決的全球公共衛(wèi)生問題。結(jié)直腸癌細胞株SW480、DLD-1、HCT116是研究結(jié)直腸癌常用的體外細胞模型，本研究通過探討人正常結(jié)直腸黏膜細胞株FHC和結(jié)直腸癌細胞株DLD-1、HCT116、SW480中miR-20a-5p和BRMS1L表達變化，選取miR-20a-5p表達最高、BRMS1L表達較低的SW480細胞進行功能試驗，并探討miR-20a-5p和BRMS1在結(jié)直腸癌細胞增殖和凋亡中的作用，以期為結(jié)直腸癌防治提供新的策略。

miRNA作為人類疾病的重要參與者，其在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中表達失調(diào)并參與細胞增殖失控、凋亡抑制和促進侵襲轉(zhuǎn)移過程地調(diào)控。miR-20a-5p是一種致癌基因，既往研究顯示肝癌[10]、三陰性乳腺癌[11]中miR-20a-5p呈高表達，其高表達促進了腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲。然而，在神經(jīng)母細胞瘤中,miR-20a-5p卻表達下調(diào)，并發(fā)揮抑癌基因作用[12]。BRMS1與組蛋白去乙?；?、特定的轉(zhuǎn)錄因子形成復合物，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，抑制多種腫瘤類型的轉(zhuǎn)移。研究[13]顯示，BRMS1在結(jié)腸癌中表達降低，檢測BRMS1是判斷結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和預后情況的重要指標。BRMS1L是BRMS1的類似物，腺癌組織中BRMS1L的表達降低與轉(zhuǎn)移以及患者較差的生存相關(guān)，BRMS1L通過誘導FZD10表觀遺傳沉默抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移[14]。在膠質(zhì)瘤中，BRMS1L表達降低與高級別膠質(zhì)瘤以及生存分析中較高的病死率顯著相關(guān)[15]。miR-934通過靶向BRMS1L促進卵巢癌細胞增殖，抑制細胞凋亡[16]。miR-93-5p通過靶向BRMS1L調(diào)控Wnt信號通路促進淚腺腺樣囊性癌的發(fā)生[17]。本研究通過功能缺失、獲得實驗分析miR-20a-5p和BRMS1L在結(jié)直腸癌細胞增殖、凋亡中的作用，發(fā)現(xiàn)抑制miR-20a-5p表達、過表達BRMS1L均可降低SW480細胞存活率，并升高細胞凋亡率。同時雙熒光素酶報告實驗證實，BRMS1L是miR-20a-5p的靶基因，miR-20a-5p可在蛋白水平負性調(diào)控BRMS1L表達。此外恢復實驗顯示，抑制BRMS1L表達還可部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-20a-5p對SW480增殖和凋亡的影響。以上研究說明，miR-20a-5p通過靶向BRMS1L在結(jié)直腸癌進展中發(fā)揮作用。

CyclinD1又叫G1/S-特異性周期蛋白-D1，其通過激活G1期特有的周期蛋白依賴性激酶，促進G1周期抑制蛋白的磷酸化，推動細胞周期向S期過渡，其過度表達可致細胞增殖失控而惡性化，是目前公認為原癌基因[18～20]。研究顯示，上調(diào)miR-20a-5p表達可有效降低腎小管上皮細胞中CyclinD1表達，誘導G1期阻滯，抑制細胞增殖[21]。Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，Caspase-3的活化可引起細胞不可逆凋亡[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-20a-5p表達、過表達BRMS1L均可降低SW480細胞中CyclinD1蛋白表達，升高Cleaved-Caspase-3蛋白的表達，且抑制BRMS1L表達還可部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-20a-5p對SW480細胞CyclinD1蛋白和Cleaved-Caspase-3蛋白表達的影響。說明抑制miR-20a-5p通過靶向上調(diào)BRMS1L可有效抑制結(jié)腸癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。

Wnt/β-catenin信號通路是一條經(jīng)典的Wnt信號通路，在多數(shù)情況下，β-catenin的過度活化可誘導腫瘤發(fā)生。研究[23～25]顯示，在多種結(jié)直腸癌中腫瘤抑制基因的突變可阻礙β-catenin的降解和磷酸化，引起β-catenin在細胞核聚集，結(jié)合T細胞轉(zhuǎn)錄因子和淋巴細胞增強因子，促進下游原癌基因表達，而抑制Wnt/β-catenin信號通路活化對腫瘤細胞的增殖、侵襲和耐藥有明顯的抑制作用，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路是結(jié)直腸癌的潛在治療靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-20a-5p表達、過表達BRMS1L均可抑制Wnt/β-catenin信號通路活化，而抑制BRMS1L表達還可部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-20a-5p對Wnt/β-catenin信號通路的影響。提示miR-20a-5p通過靶向BRMS1L表達參與結(jié)直腸癌進展和調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

總之，抑制miR-20a-5p通過靶向BRMS1L可抑制結(jié)直腸癌細胞增殖，并促進細胞凋亡，機制可能與其抑制Wnt/β-catenin信通路有關(guān)。