黃硯，楊俊卿

1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬婦女兒童醫(yī)院/成都市婦女兒童中心醫(yī)院 國(guó)家藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，四川 成都 611731；2.重慶醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，重慶 400016

舒爾經(jīng)膠囊由香附、白芍、赤芍、延胡索、柴胡、當(dāng)歸、牡丹皮等11味中藥加工而成，具有疏肝活血、調(diào)經(jīng)止痛的功效，臨床上主要用于痛經(jīng)、月經(jīng)失調(diào)屬氣滯血瘀證的治療[1]，現(xiàn)代研究表明，舒爾經(jīng)制劑可以提高去卵巢大鼠血清中雌二醇和孕酮的含量，改善血液流變性，明顯增加子宮系數(shù)，改善子宮和陰道的病理學(xué)變化，降低大鼠正常子宮活動(dòng)的頻率，顯著抑制縮宮素引起子宮平滑肌收縮的頻率及收縮強(qiáng)度[2]，對(duì)大鼠子宮肌瘤具有一定的抑制作用，對(duì)痛經(jīng)有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用[3]；舒爾經(jīng)制劑對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)[4]、經(jīng)前期綜合征[5]、氣滯血瘀型痛經(jīng)[6-7]等疾病臨床效果顯著，且不良反應(yīng)少。舒爾經(jīng)膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10704(ZD-0704)-2002-2012Z，標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)方中延胡索所含延胡索乙素進(jìn)行定量研究，中成藥復(fù)方制劑由多味中藥加工而成，每味中藥含有多種活性成分，單一成分難以全面評(píng)價(jià)舒爾經(jīng)膠囊產(chǎn)品質(zhì)量，本研究參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物以君藥為主，兼顧臣佐使藥的確定原則，采用波長(zhǎng)切換技術(shù)，選取舒爾經(jīng)膠囊方中君藥香附所含標(biāo)志性成分α-香附酮，臣藥白芍，佐藥赤芍、牡丹皮所含代表性成分氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷，佐藥延胡索所含主要活性成分延胡索乙素、紫堇堿、四氫小檗堿為定量測(cè)定研究指標(biāo)，為舒爾經(jīng)膠囊多指標(biāo)控制質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀；電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥

芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)：110736-201842，物質(zhì)數(shù)字識(shí)別號(hào)碼：23180-57-6，純度：97.4%)、α-香附酮對(duì)照品(批號(hào)：110748-201815，物質(zhì)數(shù)字識(shí)別號(hào)碼：473-08-5，純度：99.7%)、延胡索乙素對(duì)照品(批號(hào)：110726-201819，物質(zhì)數(shù)字識(shí)別號(hào)碼：2934-97-6，純度：99.8%)均來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；氧化芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)：14062505，物質(zhì)數(shù)字識(shí)別號(hào)碼：39011-91-1，純度：99.95%)、四氫小檗堿對(duì)照品(批號(hào)：PRF8050941，物質(zhì)數(shù)字識(shí)別號(hào)碼：522-97-4，純度：98.81%)均來源于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品(批號(hào)：18040323，物質(zhì)數(shù)字識(shí)別號(hào)碼：39011-90-0，純度：98.5%)、紫堇堿對(duì)照品(批號(hào)：17110821，物質(zhì)數(shù)字識(shí)別號(hào)碼：518-69-4，純度：99.6%)來源于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。

舒爾經(jīng)膠囊(規(guī)格：每粒裝0.5 g，批號(hào)分別為：180601、180901、181004)來源于海南博大制藥廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1%冰醋酸溶液，梯度洗脫(0～16.0 min，15.0%A；16.0～33.0 min，15.0%～38.0%A；33.0～42.0 min，38.0%～70.0%A；42.0～67.0 min，70.0%～78.0%A；67.0～75.0 min，78.0%～16.0%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為230 nm[8-10](0～33.0 min檢測(cè)氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷)、242 nm[11](33.0～42.0 min檢測(cè)α-香附酮)和280 nm[12-14](42.0～75.0 min檢測(cè)延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿)；體積流量：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液及樣品的制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 精密稱取氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿各對(duì)照品適量，用70%乙醇制成單組分對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(氧化芍藥苷0.858 mg·mL-1、芍藥內(nèi)酯苷3.414 mg·mL-1、芍藥苷5.198 mg·mL-1、α-香附酮0.672 mg·mL-1、延胡索乙素0.294 mg·mL-1、紫堇堿0.238 mg·mL-1、四氫小檗堿0.192 mg·mL-1)。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 分別精密量取各單組分對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2.5 mL，置同一50 mL量瓶中，用70%乙醇制成混合對(duì)照品溶液(氧化芍藥苷42.9 μg·mL-1、芍藥內(nèi)酯苷170.7 μg·mL-1、芍藥苷259.9 μg·mL-1、α-香附酮33.6 μg·mL-1、延胡索乙素14.7 μg·mL-1、紫堇堿11.9 μg·mL-1、四氫小檗堿9.6 μg·mL-1)。

2.2.3 舒爾經(jīng)膠囊樣品溶液 取舒爾經(jīng)膠囊適量，傾出內(nèi)容物，混勻，取約1.0 g，精密稱定，精密加70%乙醇25 mL，密塞，稱質(zhì)量，加熱回流[8-9，12-14]提取45 min，放冷，用70%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得舒爾經(jīng)膠囊樣品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液 按舒爾經(jīng)膠囊處方比例及制備工藝，分別制備缺香附陰性樣品、缺延胡索陰性樣品和缺白芍、赤芍、牡丹皮陰性樣品，再按2.3項(xiàng)下方法制備3種陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、舒爾經(jīng)膠囊樣品溶液和3個(gè)陰性樣品溶液適量，按照2.1項(xiàng)下色譜條件依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果所記錄色譜圖基線平穩(wěn)，待測(cè)成分氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿與其他峰均能達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按所測(cè)定色譜峰計(jì)均>4000，3種陰性樣品對(duì)測(cè)定無干擾，色譜圖見圖1。

注：A.混合對(duì)照品；B.舒爾經(jīng)膠囊樣品；C.缺白芍、赤芍、牡丹皮陰性樣品；D.缺香附陰性樣品；E.缺延胡索陰性樣品；1.氧化芍藥苷；2.芍藥內(nèi)酯苷；3.芍藥苷；4.α-香附酮；5.延胡索乙素；6.紫堇堿；7.四氫小檗堿。圖1 混合對(duì)照品和舒爾經(jīng)膠囊HPLC圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下單組分對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各2.0 mL，置于20 mL量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，制成線性關(guān)系考察混合對(duì)照溶液，再精密吸取線性關(guān)系考察混合對(duì)照溶液A各適量，用70%乙醇分別稀釋2、4、8、16、20倍，制成系列濃度的線性關(guān)系考察混合對(duì)照溶液，依法進(jìn)樣，測(cè)定氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的峰面積，以氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的質(zhì)量濃度分別對(duì)相應(yīng)峰面積進(jìn)行線性回歸，回歸方程、r、線性范圍見表1。

表1 舒爾經(jīng)膠囊7種成分的回歸方程、r及線性范圍 μg·mL-1

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的峰面積，RSD以其峰面積計(jì)分別為0.88%、0.74%、0.60%、0.95%、1.07%、1.14%和1.25%。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次舒爾經(jīng)膠囊適量，按照2.2.3項(xiàng)下方法平行制備樣品溶液6份，再按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿含量，RSD以其含量計(jì)分別為1.20%、0.43%、1.01%、1.35%、1.47%、0.82%和1.26%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份樣品溶液，室溫下0、2、4、6、10、16 h，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的峰面積，結(jié)果舒爾經(jīng)膠囊樣品溶液室溫下16 h內(nèi)穩(wěn)定，待測(cè)成分峰面積的RSD分別為0.79%、0.65%、0.54%、1.03%、1.12%、0.18%和1.46%。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批次已知含量的舒爾經(jīng)膠囊適量，傾出內(nèi)容物，混勻，取9份，每份0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液(氧化芍藥苷0.278 mg·mL-1、芍藥內(nèi)酯苷1.148 mg·mL-1、芍藥苷1.782 mg·mL-1、α-香附酮0.244 mg·mL-1、延胡索乙素0.106 mg·mL-1、紫堇堿0.084 mg·mL-1、四氫小檗堿0.052 mg·mL-1)1.0 mL 3份、2.0 mL 3份、3.0 mL 3份(約相當(dāng)于樣品含量的50%、100%、150%)，按照2.2.3項(xiàng)下方法制備加樣回收樣品溶液。按照上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率及相應(yīng)的RSD，檢測(cè)計(jì)算結(jié)果見表2。

2.3.7 樣品含量測(cè)定 取3批次的舒爾經(jīng)膠囊適量，按2.2.3項(xiàng)下方法每個(gè)批次平行制備3份舒爾經(jīng)膠囊樣品溶液，在2.1色譜條件下依法進(jìn)樣測(cè)定氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的峰面積，計(jì)算待測(cè)成分含量，結(jié)果見表3。

表2 舒爾經(jīng)膠囊7種成分的回收率(n=9)

續(xù)表2

表3 舒爾經(jīng)膠囊中7種成分含量測(cè)定結(jié)果 mg·g-1

3 討論

待測(cè)成分的選擇：舒爾經(jīng)膠囊由香附、白芍、赤芍、延胡索、柴胡、當(dāng)歸、牡丹皮等11味中藥加工而成，方中香附疏肝解郁、調(diào)經(jīng)止痛，為君藥；白芍養(yǎng)血柔肝、理氣止痛，當(dāng)歸活血補(bǔ)血，柴胡疏肝升陽，合為臣藥；赤芍、牡丹皮、桃仁清熱涼血、活血化瘀，延胡索、益母草活血止痛，陳皮理氣健脾，合為佐藥；牛膝逐瘀通經(jīng)、引血下行，為使藥。諸藥合奏，共達(dá)疏肝活血、調(diào)經(jīng)止痛之功效。本研究參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物以君藥為主，兼顧臣佐使藥的確定原則，選取君藥香附、臣藥白芍及佐藥赤芍、牡丹皮和延胡索為研究對(duì)象，香附為莎草科植物莎草的干燥根莖，主要含萜類、黃酮類、酚類、生物堿、揮發(fā)油類等化合物，α-香附酮為其特征性成分；白芍為毛茛科植物芍藥的干燥根，氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷等單萜類成分為其主要活性成分；赤芍為毛莨科植物芍藥或川赤芍的干燥根，牡丹皮為毛莨科植物牡丹的干燥根皮，均含有芍藥苷、氧化芍藥苷等成分；延胡索為罌粟科植物延胡索的干燥塊莖，延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿等異喹啉類生物堿為其主要有效成分。本研究選取舒爾經(jīng)膠囊香附所含α-香附酮，臣藥白芍、佐藥赤芍、牡丹皮所含氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷，佐藥延胡索所含延胡索乙素、紫堇堿、四氫小檗堿為定量測(cè)定指標(biāo)，為全面評(píng)價(jià)舒爾經(jīng)膠囊提供數(shù)據(jù)支持。

流動(dòng)相的確定：實(shí)驗(yàn)過程中，以待測(cè)成分氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的分離度、色譜峰的尖銳程度、對(duì)稱程度以及色譜圖基線平穩(wěn)情況等為指標(biāo)，首先對(duì)比考察了甲醇-水流動(dòng)相體系[11，15]、乙腈-水流動(dòng)相體系，結(jié)果顯示，乙腈-水流動(dòng)相體系下待測(cè)成分氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿分離度、峰形及色譜圖基線較甲醇-水流動(dòng)相體系下效果好，但所測(cè)成分芍藥內(nèi)酯苷、延胡索乙素和四氫小檗堿色譜峰存在拖尾現(xiàn)象；在此基礎(chǔ)上分別考察了乙腈-0.1%冰醋酸溶液流動(dòng)相體系[9，13]和乙腈-0.1%磷酸溶液流動(dòng)相體系[8，10，12]，通過對(duì)流動(dòng)相比例的不斷摸索研究，最終確定采用乙腈-0.1%冰醋酸溶液為流動(dòng)相，按照文中2.1項(xiàng)下流動(dòng)相比例進(jìn)行梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)對(duì)舒爾經(jīng)膠囊中氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的同時(shí)測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)首次建立一種HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定舒爾經(jīng)膠囊中氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的含量，實(shí)現(xiàn)了對(duì)舒爾經(jīng)膠囊多種有效成分的質(zhì)量控制。