李欣，孟磊，魏勝利，2*，祁曉娟，卓冰雨

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102

何首烏為蓼科何首烏PolygonummultiflorumThunb.的干燥塊根，有解毒截瘧、潤腸通便、補益肝腎之功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究證明，何首烏主要有補血、抗氧化、抗衰老、抗動脈粥樣硬化及神經(jīng)保護等作用[2-3]，其藥效成分主要包括二苯乙烯苷類、結(jié)合蒽醌類和游離蒽醌類[4-6]，同時也是何首烏質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)。但近年來，隨著何首烏種植區(qū)域的改變[7-8]，其質(zhì)量控制日益困難。已報道不同產(chǎn)地何首烏功效組分含量存在顯著性差異[9]，甚至基因序列都已發(fā)生改變[10]。如何從全國種植區(qū)域范圍內(nèi)甄選出特定功效組分的何首烏，是何首烏臨床“精準(zhǔn)用藥”的首要難題。本研究通過典型相關(guān)分析方法，研究何首烏主產(chǎn)地的環(huán)境因子與品質(zhì)的相關(guān)性，以期得到何首烏質(zhì)量形成規(guī)律，為特種功效組分何首烏選擇提供科學(xué)依據(jù)，其結(jié)果對何首烏產(chǎn)地質(zhì)量評價與臨床“精準(zhǔn)用藥”均有指導(dǎo)意義。

1 材料

1.1 試藥

實驗材料來源于何首烏傳統(tǒng)的道地產(chǎn)區(qū)與現(xiàn)在的主要產(chǎn)區(qū)，包括廣東、貴州、湖北、四川、云南、廣西、湖南、山西、安徽、陜西、重慶、河南，共計12個省區(qū)，20批樣品。具體采樣信息見表1。所有樣品經(jīng)50 ℃烘干后作為分析樣品，樣品標(biāo)本經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)魏勝利教授鑒定為何首烏PolygonummultiflorumThunb.正品。

反式二苯乙烯苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：110844-20512，純度：99.0%)，大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8-O-β-D葡萄糖苷(中國食品藥品檢定研究院，純度>98%，批號分別為：110750-200110、110758-201415、110758-21415)，大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷(上海源葉生物科技有限公司，純度>98%，批號：Z25F8B30059)，甲醇和乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)，水為屈臣氏蒸餾水，其余試劑均為分析純。順式-二苯乙烯苷參考文獻方法[11]，通過反式-二苯乙烯苷在紫外365 nm下轉(zhuǎn)化而得。

表1 不同產(chǎn)地何首烏樣品信息

1.2 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，配備G1314F 1260 VWD 檢測器、Agilent 色譜工作站；KQ5200D型超聲清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；ME104型萬分之一電子分析天平(美國METTLER TOLEDO公司)；BT 25S型十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司)；FW100型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 方法

采用文獻報道的HPLC一測多評法通過何首烏中的反式二苯乙烯苷含量對順式二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚6個單體成分定量(見圖1)[12]。

2.1 供試品溶液制備

精密稱取何首烏粉末(過四號篩)0.5 g，置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，于室溫下超聲1 h(200 W，40 kHZ)，放冷，稱質(zhì)量，用甲醇補足損失的質(zhì)量，搖勻，過濾(0.22 μm微孔濾膜)。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取6種對照品適量，加甲醇配成含順式二苯乙烯苷0.016 7 mg·mL-1、反式二苯乙烯苷0.167 mg·mL-1、大黃素-8-O-β-D葡萄糖苷0.042 1 mg·mL-1、大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷0.020 3 mg·mL-1、大黃素0.010 3 mg·mL-1、大黃素甲醚0.007 4 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18(120 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃，樣品溫度：4 ℃，流速：1.0 mL·min-1，280 nm檢測，進樣量：10 μL。流動相A(甲醇)，B(0.1%磷酸)，梯度洗脫(0 min，95%B；10 min，75%B；20 min，55%B；30 min，30%B；35 min，20%B；40 min，10%B；45 min，10%B)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別進樣1、2、5、10、15、20 μL，以進樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程為：Y=1638X+111.43(r=0.999 7)，反式二苯乙烯苷在0.240 6～4.812 0 μg與峰面積間的線性關(guān)系良好。

2.4.2 相對校正因子 除反式二苯乙烯苷外其他濃度計算方法為：

Ci=fsi×Cs×Ai/As

(1)

式中，C為濃度，f為相對校正因子，A為峰面積，Cs是求出的樣品反式二苯乙烯苷濃度，Ci是樣品其他成分含量濃度。其中何首烏中順式二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚5種成分與反式二苯乙烯苷的相對校正因子分別為1.054、2.160、2.072、2.451、2.184。

注：A.6種混合對照品；B.何首烏樣品溶液；1.順式二苯乙烯苷；2.反式二苯乙烯苷；3.大黃素-8-O-β-D葡萄糖苷；4.大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷；5.大黃素；6.大黃素甲醚。圖1 混合對照品和供試品溶液6種成分的HPLC圖

2.4.3 重復(fù)性考察 取同一產(chǎn)地的何首烏粉末1.0 g(過四號篩)，精密稱定，平行6份，采用2.1項下供試品溶液的制備方法，2.3項下的色譜條件進樣測定。

2.4.4 精密度考察 精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，并計算RSD。

2.4.5 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在制備樣品后的0、2、4、8、12、16、24 h進樣，測定峰面積，計算順式二苯乙烯苷、反式二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚的RSD。

2.4.6 加樣回收率 取同一批己知含量的何首烏粉末(過四號篩)約0.2 g，平行6份，精密稱定，分別按樣品含量∶對照品量(1∶1)的比例大致加入一定量的順式二苯乙烯苷、反式二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚的混合對照品溶液。按照2.1項下的方法制備供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液10 μL，測定并計算各成分的加樣回收率及RSD(見表2)。

2.5 數(shù)據(jù)來源及處理方法

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)地何首烏活性成分含量差異分析

不同產(chǎn)地何首烏6種活性成分含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，二苯乙烯苷類總量、結(jié)合蒽醌類總量、游離蒽醌類總量的最高值和最低值分別相差4.8、30.0和21.7倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表3)。其中，大黃素、大黃素甲醚、大黃素葡萄糖苷最高均產(chǎn)自四川冕寧，分別為1.607 2%、0.499 7%、1.338 3%，順式二苯乙烯苷含量最高產(chǎn)自重慶錢塘(0.147 5%)，反式二苯乙烯苷最高均產(chǎn)自湖北武當(dāng)山(7.607 4%)，大黃素甲醚葡萄糖苷含量最高產(chǎn)自廣東德慶(0.168 2%)；大黃素含量以廣西西林(0.085 6%)最低，其他5種成分：順式二苯乙烯苷、反式二苯乙烯苷、大黃素甲醚、大黃素甲醚葡萄糖苷、大黃素葡萄糖苷含量最低均產(chǎn)自廣東陽春，分別為0.014 2%、1.559 8%、0.065 3%、0.021 4%、0.027 8%。

另外，四川冕寧的何首烏游離蒽醌類總量與結(jié)合蒽醌類總量均最高，分別為2.106 9%、1.479 5%；湖北武當(dāng)山的何首烏二苯乙烯苷類總量最高，為7.720 2%；廣東陽春的何首烏二苯乙烯苷類總量、結(jié)合蒽醌類總量均最低，為1.574 1%和0.049 3%，而游離蒽醌類總量最低產(chǎn)自廣西西林(0.083 7%)(見圖2)。

此外，何首烏體內(nèi)含量最高的成分為反式二苯乙烯苷，平均達到了3.704 2%，其次為大黃素、大黃素苷、大黃素甲醚，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達到了0.456 4%、0.330 4%和0.169 9%。最低的是大黃素甲醚葡萄糖苷，平均只有0.039 7%，與文獻[9]結(jié)果一致。

3.2 何首烏質(zhì)量與氣候因子相關(guān)分析

3.2.1 簡單相關(guān)分析 對何首烏6種成分含量與7種環(huán)境因子做相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。從表4中可以看出，“氣候組”年均溫與緯度、海拔呈極顯著負相關(guān)，r分別為-0.631、-0.573，1月最低氣溫與年均溫呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，r為0.649，與緯度的r為-0.846，相關(guān)性極顯著?！百|(zhì)量組”反式二苯乙烯苷與緯度、海拔呈顯著正相關(guān)，與1月最低氣溫顯著負相關(guān)；結(jié)合蒽醌類與7月最高氣溫、年均氣溫均呈顯著或極顯著負相關(guān)關(guān)系，r達-0.855；游離蒽醌與經(jīng)度、7月最高氣溫呈極顯著或顯著負相關(guān)。

表2 含量測定方法學(xué)考察

表3 不同產(chǎn)地何首烏6種活性成分含量測定結(jié)果 mg·g-1

注：*P<0.05；**P<0.01；—表示未檢出。

表4 生態(tài)環(huán)境因子與藥材質(zhì)量的簡單相關(guān)分析

注：*P<0.05；**P<0.01。

圖2 何首烏功效組分比較圖

3.2.2 典型相關(guān)分析 根據(jù)20個產(chǎn)地收集的數(shù)據(jù)和含量測定的結(jié)果，得到X1～6和Y1～6的典型相關(guān)系數(shù)分別是0.969 0、0.925 2、0.846 1、0.700 7、0.529 3、0.308 5，表明第1、第2對典型變量解釋能力較強，顯著性檢驗后發(fā)現(xiàn)相關(guān)關(guān)系顯著，故可以用“氣候組”來解釋藥材“質(zhì)量組”。

本實驗采用標(biāo)準(zhǔn)化的典型相關(guān)系數(shù)建立典型相關(guān)模型。由表5可見，何首烏藥材質(zhì)量受氣候因素影響可用2對典型相關(guān)變量描述。

表5 何首烏氣候組與質(zhì)量組典型相關(guān)分析

第1對典型變量模型為 V1=-0.339 6X1-0.083 7X2+0.391 7X3-0.439 0X4+0.974 6X5+0.876 9X6+0.011 3X7，7月最高氣溫和年均溫典型載荷最高，表明氣候組變化主要受7月最高氣溫和年均溫控制；W1=0.571 1Y1+0.057 5Y2-0.593 3Y3-0.429 8Y4+0.169 4Y5-0.103 1Y6，大黃素葡萄糖苷和順式二苯乙烯苷典型載荷最高，表明質(zhì)量組主要由大黃素葡萄糖苷和順式二苯乙烯苷控制。因此，第1對典型變量模型顯示氣候與質(zhì)量的相關(guān)性主要由7月最高氣溫、年均溫與大黃素葡萄糖苷、順式二苯乙烯苷含量之間的相關(guān)關(guān)系主導(dǎo)。同樣，第2對典型變量模型V2=-1.036 5X1-0.224 7X2-0.185 2X3-0.508 2X4-0.124 2X5+0.745 1X6+0.089 3X7，W2=0.881 4Y1-0.590 4Y2-0.747 0Y3+0.789 9Y4+0.169 6Y5+0.567 0Y6，第2對典型變量模型顯示氣候與質(zhì)量的相關(guān)性主要受經(jīng)度與順式二苯乙烯苷、大黃素葡萄糖苷、大黃素甲醚葡萄糖苷相關(guān)關(guān)系主導(dǎo)。

由典型相關(guān)分析可知，何首烏藥材質(zhì)量主要由大黃素葡萄糖苷、順式二苯乙烯苷、大黃素甲醚葡萄糖苷含量主導(dǎo)，此3類成分主要受7月最高氣溫、年均溫、經(jīng)度氣候因子控制，與簡單相關(guān)分析結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論與討論

現(xiàn)代研究中，何首烏主要的藥效成分有2大類：二苯乙烯苷與蒽醌類，其中，蒽醌又可分為游離蒽醌與結(jié)合蒽醌，此3類成分也是何首烏及其相關(guān)中藥制品質(zhì)量檢測的重要指標(biāo)。

二苯乙烯苷屬于多羥基酚類化合物，具有抗衰老[14]、抗腫瘤[15]、防治血栓[16-17]、提高記憶力[18-19]、保肝[20]等藥理活性，與何首烏補益肝腎的功效密切相關(guān)?！吨腥A人民共和國藥典》[1]規(guī)定何首烏中二苯乙烯苷含量不得少于1%，本實驗中20批不同產(chǎn)地的何首烏二苯乙烯苷含量均達到要求，且四川冕寧含量最高，達6.690 4%。相關(guān)性分析結(jié)果反映，順式二苯乙烯苷與經(jīng)度正相關(guān)，反式二苯乙烯苷與緯度、海拔正相關(guān)，與1月最低氣溫負相關(guān)，此結(jié)果與光照和溫度對二苯乙烯苷合成途徑中的苯丙氨酸解氨酶基因的表達、調(diào)控影響效果一致[21-22]。結(jié)合二苯乙烯苷類的藥理活性，高海拔、溫差大的湖北武當(dāng)山及其相似環(huán)境有利于二苯乙烯苷的積累，所產(chǎn)的何首烏具有補益肝腎的潛在優(yōu)勢。

蒽醌類成分在蓼科廣泛分布[23]，有較強的藥理活性。游離蒽醌類成分可抗菌、抗炎、抗病毒，在解毒截瘧等功效上有潛在優(yōu)勢；結(jié)合蒽醌類成分有致瀉活性，是何首烏潤腸通便作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究中，各產(chǎn)地何首烏蒽醌類成分含量相差20～30倍，表明產(chǎn)地對何首烏質(zhì)量蒽醌類成分形成有重要影響。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)合蒽醌類與7月最高氣溫、年均氣溫均呈顯著或極顯著負相關(guān)，游離蒽醌與經(jīng)度、7月最高氣溫呈極顯著或顯著負相關(guān)。結(jié)合蒽醌類成分的藥理活性，低溫、低濕的四川冕寧及其相似環(huán)境有利于蒽醌類成分的積累，所產(chǎn)的何首烏具有截瘧解毒、潤腸通便的潛在優(yōu)勢。何首烏的肝毒性也是近年來研究的熱點之一，而關(guān)于何首烏肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的報道，二苯乙烯苷類和蒽醌類成分均有所提及，但至今無統(tǒng)一的說法，可能與兩者在機體內(nèi)會相互影響有關(guān)，推測兩類成分可能存在雙向調(diào)節(jié)作用[24]。且有報道何首烏蒽醌類成分達到肝毒性的服用劑量遠遠超出何首烏的臨床使用劑量[25]，除此之外，何首烏在高濃度、長時間作用下有細胞毒性，會引發(fā)肝毒性等不良反應(yīng)[26]。因此，何首烏的使用需遵從醫(yī)囑。

綜上所述，產(chǎn)地是何首烏藥材質(zhì)量形成的主要因素，根據(jù)特定功效選擇適宜產(chǎn)區(qū)的何首烏，是目前臨床用藥的需求，也是中藥質(zhì)量控制的目標(biāo)。本研究確定了不同功效型何首烏的主要產(chǎn)地環(huán)境影響因子，為何首烏用藥選擇和質(zhì)量評價提供一定的參考價值。但闡明何首烏質(zhì)量形成機制，并將其應(yīng)用于何首烏生產(chǎn)調(diào)控，實現(xiàn)何首烏精準(zhǔn)化質(zhì)量控制，還有很長的路要走。