馮碩

摘? 要：近紅外熒光探針的發(fā)射波長(zhǎng)能避免生物組織的干擾，對(duì)生物成像有較高的效率。文章對(duì)鈀檢測(cè)、N2H4檢測(cè)、苯硫酚檢測(cè)作為近紅外熒光探針的合成、表征及具體在細(xì)胞中應(yīng)用的分析。希望能為近紅外熒光探針的更多應(yīng)用和發(fā)展趨勢(shì)做出不一樣的分析方向。

關(guān)鍵詞：近紅外熒光探針;鈀檢測(cè);N2H4檢測(cè);苯硫酚檢測(cè)

中圖分類號(hào)：O657.33? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號(hào)：2095-2945（2020）14-0095-02

Abstract： The emission wavelength of near-infrared fluorescence probe can avoid the interference of biological tissue and has high efficiency for biological imaging. In this paper， palladium detection， N2H4 detection， thiophenol detection as near-infrared fluorescence probe synthesis， characterization and specific application in cells were analyzed. It is hoped that it can make a different analysis method for more applications and development trends of near-infrared fluorescence probes.

Keywords： near-infrared fluorescence probe; palladium detection; N2H4 detection; thiophenol detection

多數(shù)熒光探針有著自身限制，具體表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)上和形態(tài)上的差異，所以大多數(shù)的熒光探針的發(fā)射波長(zhǎng)被限制在了650nm之下，因此不能準(zhǔn)確靈敏地去進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)成分檢測(cè)，會(huì)被樣品的發(fā)射波長(zhǎng)所干擾。

但近紅外熒光探針在這方面有很好的改進(jìn)之處，發(fā)射波長(zhǎng)超過(guò)650nm，能夠避免樣本的自發(fā)熒光干擾，從而將熒光的化學(xué)分析和生物熒光成像做到高靈敏度，所以近紅外熒光探針的應(yīng)用越來(lái)越廣，準(zhǔn)確度也越來(lái)越高，幫助科研院所更快地取得了眾多的成果研究。

1 近紅外熒光探針的合成、表征

1.1 近紅外熒光探針CyPd的合成、表征

1.1.1 探針CyPd的合成

在對(duì)探針CyPd的合成中，要在一個(gè)充分安全的環(huán)境保護(hù)下進(jìn)行合成的操作，選用較為穩(wěn)定的零攝氏度和安全氣體氮來(lái)作為基礎(chǔ)環(huán)境。將Cy化合物與三乙胺共同溶解，并和二氯甲烷溶液混合。再接下來(lái)將此混合溶液靜置，把六甲酸稀丙酯滴進(jìn)此溶液，為保證安全性與實(shí)驗(yàn)效果，需采用注射器的方式逐滴混合攪拌約30分鐘，室溫過(guò)夜。最后將此溶液進(jìn)行減壓蒸發(fā)得到固化物，此時(shí)的粗產(chǎn)品還需經(jīng)過(guò)硅膠柱提純則可得到探針CyPd，外形為藍(lán)色固體。

1.1.2 探針CyPd的表征

在熒光成像分析中，可以看到探針CyPd的溶液顏色在不同的操作下有明顯的變化。比如加入了緩沖溶液后，探針CyPd的熒光成像有明顯的減弱趨勢(shì);在694nm的發(fā)射波長(zhǎng)下，顏色由紫變藍(lán);發(fā)射波長(zhǎng)為721nm時(shí)的感光強(qiáng)度最強(qiáng)，熒光成像圖中呈現(xiàn)一波高峰。

1.2 近紅外熒光探針DCMC的合成、表征

1.2.1 探針DCMC的合成

探針DCMC的合成依舊要在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行合成實(shí)驗(yàn)，目的是在探針DCMC的制取中隔絕氧氣，以防止元素在氧氣中產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)，影響實(shí)驗(yàn)的中間產(chǎn)物以致結(jié)果的不理想。將DCM的化合物與三乙胺共同溶解，并和二氯甲烷溶液混合。再接下來(lái)將此其中反應(yīng)溫度要控制在零攝氏度后靜置，把乙酰氯溶液滴進(jìn)此混合溶液，為保證安全性與實(shí)驗(yàn)效果，需采用注射器的方式逐滴混合，約預(yù)留出反應(yīng)時(shí)間30分鐘后進(jìn)行減壓蒸發(fā)得到固化物，此時(shí)的粗產(chǎn)品還需經(jīng)過(guò)用占比為50份的二氯甲烷比1份的甲醇利用硅膠柱提純法精提純，則可得到探針DCMC，外形為黃色固體。

1.2.2 探針DCMC的表征

在熒光成像分析中，肉眼可見(jiàn)加入了探針DCMC的溶液顏色在不同的操作下有明顯的變化。比如不同濃度的N2H4溶液在加入到探針DCM溶液中，顏色由淡黃變成紫紅;另外根據(jù)熒光光譜來(lái)看，沒(méi)加入N2H4，未顯示有熒光反應(yīng)和紫外線吸收現(xiàn)象;加入N2H4后，則有很強(qiáng)的熒光反應(yīng)，借此證明了近紅外熒光探針DCMC對(duì)N2H4的檢測(cè)效果。

1.3 近紅外熒光探針DCM-CHO-D的合成、表征

1.3.1 探針DCM-CHO-D的合成

探針DCM-CHO-D的合成要在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行，目的是在探針DCM-CHO-D的制取中防止各個(gè)活躍元素在含有氧氣的反應(yīng)環(huán)境中產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，以致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不嚴(yán)謹(jǐn)。將探針DCM-CHO-D與三乙胺都按順序加入到二氯甲烷溶液中并使其充分溶解，將反應(yīng)溫度要控制在零攝氏度后靜置得到溶液一。然后需要制備把2，4-二硝基苯磺酰氯溶于二氯甲烷的混合溶液，得到溶液二，使用注射器把溶液二滴進(jìn)溶液一中，在零攝氏度的反應(yīng)溫度下約預(yù)留出反應(yīng)時(shí)間10分鐘后，攪拌充分室溫過(guò)夜。進(jìn)行減壓蒸發(fā)法得到固化物，此時(shí)的粗產(chǎn)品還需經(jīng)過(guò)用到占比為50份的二氯甲烷比1份的甲醇作為洗脫劑，利用色譜硅膠柱提純法精提純，則可得到探針DCM-CHO-D，外形為紅色粉末[1]。

1.3.2 探針DCM-CHO-D的表征

本實(shí)驗(yàn)所選的細(xì)胞為HeLa，進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞的選取后，將其置于96孔板中，期間要注意保證細(xì)胞的貼壁，培養(yǎng)時(shí)間控制在約24小時(shí)。然后用PBS溶液進(jìn)行洗滌，洗滌次數(shù)三次為宜，加入探針DCMC做繼續(xù)培養(yǎng)，時(shí)間控制在約30分鐘，培養(yǎng)結(jié)束再次用PBS溶液進(jìn)行三次洗滌，繼而在顯微鏡下進(jìn)行對(duì)HeLa細(xì)胞的熒光成像分析。接著再加入苯硫酚溶液在培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞孵育約30分鐘，再次用PBS溶液進(jìn)行三次徹底的洗滌，使培養(yǎng)基中能夠去除殘留的苯硫酚成分。最后用熒光顯微鏡對(duì)HeLa細(xì)胞熒光成像分析。

檢測(cè)苯硫酚使用近紅外熒光探針DCM-CHO-D，在加入了探針DCM-CHO-D后待測(cè)苯硫酚溶液顏色在不同的操作下有不同的變化。比如不同濃度的苯硫酚溶液在加入到探針DCM-CHO-D溶液中，顏色由淡黃變成粉紅;另外根據(jù)熒光光譜來(lái)看，沒(méi)加入大劑量的苯硫酚溶液前的緩沖液中，僅顯示有較微弱的熒光反應(yīng)和紫外線吸收現(xiàn)象;加入N2H4后，則有很強(qiáng)的熒光反應(yīng)，在一定范圍內(nèi)苯硫酚的加入與熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)。

2 近紅外熒光探針的應(yīng)用分析

2.1 近紅外熒光探針對(duì)鈀檢測(cè)的應(yīng)用分析

2.1.1 對(duì)鈀檢測(cè)的應(yīng)用機(jī)理

鈀檢測(cè)是使用探針CyPd來(lái)作為近紅外熒光探針的選擇，探針CyPd其中有作為信號(hào)作用的CyH、起到識(shí)別作用的碳酸烯丙酯，二者的相互配合，將電荷的轉(zhuǎn)移隔斷，從而起到能夠發(fā)射熒光波長(zhǎng)和接收并吸收紫外照射的作用。熒光光譜的顯示其實(shí)就是反映了待測(cè)樣本其中的電荷移動(dòng)趨勢(shì)，當(dāng)探針CyPd對(duì)鈀的檢測(cè)中，熒光光譜的波峰有明顯的波動(dòng)范圍，說(shuō)明探針CyPd對(duì)紫外線的吸收和對(duì)熒光的反射有較高的敏感度，進(jìn)一步證明近紅外熒光探針CyPd能夠?qū)︹Z檢測(cè)的最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做充分的數(shù)據(jù)保證[2]。

2.1.2 應(yīng)用于細(xì)胞中的檢測(cè)

在對(duì)選用的HeLa細(xì)胞中的檢測(cè)，為了防止細(xì)胞被損壞，可以進(jìn)行不對(duì)細(xì)胞造成損害的細(xì)胞成像的影像技術(shù)來(lái)觀察近紅外熒光探針CyPd對(duì)鈀檢測(cè)的應(yīng)用。首先要保持HeLa細(xì)胞的活性，不要對(duì)細(xì)胞膜的通透性產(chǎn)生影響，這樣對(duì)鈀的檢測(cè)會(huì)出現(xiàn)數(shù)據(jù)偏差。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在鈀元素的不同價(jià)態(tài)下，作為是化合物的PdCl2是危害最大、毒性最強(qiáng)的存在，所以實(shí)驗(yàn)選擇PdCl2作為HeLa細(xì)胞成像的關(guān)鍵要素。數(shù)據(jù)顯示，在沒(méi)有加入鈀元素化合物前，熒光光譜未顯示有熒光反應(yīng)，在加入了PdCl2之后，熒光反應(yīng)強(qiáng)烈。所以證明了近紅外熒光探針CyPd對(duì)鈀檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)中，探針CyPd對(duì)鈀元素的檢測(cè)及時(shí)且準(zhǔn)確，而且很好地穿透了細(xì)胞膜且并未對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生影響。

2.2 近紅外熒光探針對(duì)N2H4檢測(cè)的應(yīng)用分析

2.2.1對(duì)N2H4檢測(cè)的應(yīng)用機(jī)理

探針DCMC對(duì)N2H4進(jìn)行檢測(cè)，是因?yàn)樘结楧CMC中含有信號(hào)集團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)，分別是由DCM-OH負(fù)責(zé)發(fā)出信號(hào)、乙酰基負(fù)責(zé)識(shí)別信號(hào)作為對(duì)N2H4進(jìn)行檢測(cè)工作原理。近紅外熒光探針DCMC里DCM-OH信號(hào)基團(tuán)被識(shí)別基團(tuán)乙?；Ｗo(hù)在內(nèi)核部分，做熒光檢測(cè)時(shí)，由于能夠發(fā)出信號(hào)的DCM-OH被包含在內(nèi)部，熒光發(fā)出波長(zhǎng)但不能與分子內(nèi)電荷發(fā)生反應(yīng)所以會(huì)顯示熒光猝滅;當(dāng)檢測(cè)成分中含有N2H4時(shí)，分子內(nèi)的電荷可以與N2H4發(fā)生反應(yīng)，所以會(huì)顯示熒光發(fā)射和紫外線吸收的光譜圖，進(jìn)一步證明近紅外熒光探針DCMC能夠?qū)2H4檢測(cè)[3]。

2.2.2 應(yīng)用于細(xì)胞中的檢測(cè)

在進(jìn)行細(xì)胞成像中，可以從實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程里看出，在沒(méi)有加入時(shí)，熒光光譜圖未顯示有熒光發(fā)射，而在加入微量N2H4后，就會(huì)有熒光發(fā)射和紫外吸收的現(xiàn)象發(fā)生。如果繼續(xù)加大N2H4的劑量，熒光發(fā)射和紫外吸收的現(xiàn)象也會(huì)越明顯，這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有利于后續(xù)對(duì)人類的生產(chǎn)生活產(chǎn)生持續(xù)的重要影響。所以探針DCMC在檢測(cè)中和細(xì)胞的兼容性很好，而且可以將活細(xì)胞中微量的檢測(cè)成分N2H4也能清晰地展現(xiàn)出來(lái)，說(shuō)明近紅外熒光探針DCMC在生物活體上面做檢測(cè)不會(huì)損害細(xì)胞活性。

2.3 近紅外熒光探針對(duì)苯硫酚檢測(cè)的應(yīng)用分析

2.3.1 對(duì)苯硫酚檢測(cè)的應(yīng)用機(jī)理

探針DCM-CHO-D對(duì)苯硫酚能夠進(jìn)行檢測(cè)是因?yàn)樘结楧CM-CHO-D中是由2，4-二硝基苯磺酸酯負(fù)責(zé)識(shí)別信號(hào)、DCM-CHO-OH負(fù)責(zé)發(fā)出信號(hào)作為對(duì)苯硫酚進(jìn)行檢測(cè)工作原理。探針DCM-CHO-D里DCM-CHO-OH信號(hào)基團(tuán)被2，4-二硝基苯磺酸酯保護(hù)，做熒光檢測(cè)時(shí)被切斷了電荷的移動(dòng)過(guò)程，所以熒光不會(huì)被發(fā)射;當(dāng)加入苯硫酚時(shí)，苯磺酸酯與苯硫酚發(fā)生反應(yīng)被水解，電荷可以進(jìn)行轉(zhuǎn)移引起了熒光發(fā)射和紫外線吸收的變化[4]。

2.3.2 應(yīng)用于細(xì)胞中的檢測(cè)

在對(duì)活細(xì)胞的苯硫酚檢測(cè)中，對(duì)探針DCM-CHO-D進(jìn)行細(xì)胞成像分析，發(fā)現(xiàn)加入苯硫酚之后熒光光譜顯示紅色熒光，未加之前細(xì)胞并未出現(xiàn)熒光。近紅外熒光探針DCM-CHO-D在苯硫酚檢測(cè)中細(xì)胞兼容性很好，說(shuō)明探針DCM-CHO-D在生物活體上很友好，不會(huì)損害生物體細(xì)胞。

綜上所述，以三類檢測(cè)物進(jìn)行具體分析近紅外熒光探針的合成、表征及應(yīng)用。探針CyPd可以對(duì)鈀檢測(cè)做出快速反應(yīng)，探針DCMC可以將微量的N2H4高靈敏的檢出，探針DCM-CHO-D能在保持細(xì)胞活性的基礎(chǔ)上檢測(cè)苯硫酚。未來(lái)近紅外熒光探針的發(fā)展還需要新時(shí)代的科研人才去繼續(xù)開(kāi)發(fā)創(chuàng)造。

參考文獻(xiàn)：

[1]張逢源，劉曉燕，葉為春.一種近紅外熒光探針的合成、表征及應(yīng)用[J].分析測(cè)試技術(shù)與儀器，2019，25（04）：228-231.

[2]于雪，包青青，姜超.花菁類近紅外熒光探針在生物檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展，2019，38（12）：5492-5503.

[3]宋艷，黃文才，齊慶蓉.可用于肼檢測(cè)的新型近紅外熒光探針的合成及初步性能研究[J].華西藥學(xué)雜志，2019，34（04）：325-331.

[4]蘇偉.幾種近紅外熒光探針的合成表征及其實(shí)際應(yīng)用[D].湖南師范大學(xué)，2017.