趙翔宇，何振宇, 宰守峰△

(1.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院腫瘤外科(普瘤一科)，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，廣東 中山 528400)

胃癌是全球第四大最常見的癌癥，也是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，特別是在東亞國家，如日本和中國。雖然胃癌的治療方法很多，如化療、放療和手術(shù)，臨床療效逐漸改善，但副作用和死亡率仍然很高。主要是因?yàn)槲赴┰缙诎Y狀不明顯，癌基因的突變[1]以及患者被診斷時(shí)已是晚期或者錯(cuò)過了最佳治療機(jī)會(huì)，因此患者5年生存率較低[2]。因此，開發(fā)高效、副作用小的抗腫瘤藥物對胃癌患者至關(guān)重要。由于天然產(chǎn)物對抗癌藥物發(fā)現(xiàn)的巨大貢獻(xiàn),天然產(chǎn)物已經(jīng)是研究潛在抗癌藥物的重要資源[3]。人參是一種很受歡迎的中草藥已被報(bào)道具有多種生物活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗腫瘤作用。其主要活性成分為人參皂苷，其中有藥理活性的大約有30多種，主要包括參皂苷(G)-Rb1，G-K，Rb2，G-Rd，G-Re，G-Rg1，G-Rg3，G-Rg5，G-Rh1，G-Rh2[4]。眾所周知其中Rh2，Rg3和G-K具有抗癌作用。人參皂苷Rh2通過caspase依賴的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。人參皂苷Rg3抑制A549細(xì)胞增殖，引發(fā)細(xì)胞凋亡。人參皂苷K抑制BGC823和SGC7901細(xì)胞的活性，并觸發(fā)G2期阻滯。然而，關(guān)于Rg3和Rg5抗胃癌的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究旨在比較Rg3和Rg5抗胃癌的活性，篩選出抗胃癌活性高的化合物并對其機(jī)制進(jìn)行研究，為抗胃癌藥物提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人參皂苷Rg3和Rg5均購于Sigma公司，純度大于等于98%，其他試劑在下述實(shí)驗(yàn)方法中具體說明。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常胃粘膜細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞株AGS、MKN-45來源于中國科學(xué)研究院上海研究所。GES-1和AGS細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基(上海源培生物有限公司)培養(yǎng)，MKN-45細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基(上海源培生物有限公司)中培養(yǎng)，DMEM 和RPMI-1640培養(yǎng)基均添加10% FBS(Thermo公司)和1%的青霉素和鏈霉素(Gibco公司)，培養(yǎng)條件是在37℃，5% CO2。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將細(xì)胞種于96孔板中，密度為1×104cells/well，加入不同濃度梯度的Rg3和Rg5(10、20、30、40、50 μmol/L)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，通過CCK-8檢測細(xì)胞存活率。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、Transwell小室分析遷移和免疫印跡法及ELISA法檢測相關(guān)蛋白。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞的存活率

用CCK-8試劑盒(東仁化學(xué)科技有限公司)測定了Rg3和Rg5對胃癌細(xì)胞和GES-1細(xì)胞生長的影響。藥物處理后用PBS清洗后加入10 μl 的 CCK-8 溶液，經(jīng)過 2 h 37℃ 培養(yǎng)后，使用酶標(biāo)儀在 450 nm 的吸光度測定其吸光度值。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

細(xì)胞周期檢測采用細(xì)胞周期檢測試劑盒(貝博生物有限公司)，采用流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6l)按照說明書進(jìn)行檢測。收集經(jīng)過不同濃度Rg5(5、10、20 μmol/L)處理的人胃癌MNK-45細(xì)胞，細(xì)胞用PBS清洗三次后，以1 000 r/min離心3～5 min至沉淀細(xì)胞。將上述收集的細(xì)胞加入500 μl 70% 的乙醇在-20℃過夜。第2日棄去乙醇加入PBS清洗三次后在黑暗中加入2 μl 20 μg/ml溶液(PI)避光染色30 min。用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布。

1.6 Transwell小室分析

MKN-45細(xì)胞在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基含有不同濃度的Rg5(0、5、10、20 μmol/L),加入上層小室中，下室加入而500 μl完全培養(yǎng)基。37℃孵育24 h后，取膜上表面細(xì)胞，4%多聚甲醛固定膜下表面細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫室溫染色10 min。在100倍放大的顯微鏡下，隨機(jī)選擇每個(gè)Transwell膜的6視野個(gè)進(jìn)行拍照。遷移通過計(jì)算遷移到Transwell膜下的細(xì)胞數(shù)，評估MKN-45細(xì)胞遷移率。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)

取生長狀況良好的MKN-45細(xì)胞，以1×106cells/ml接種于6孔板中，第2日加入分別加入不同濃度的Rg5(0、10、20 μm)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗后離心收集細(xì)胞。加入RIPA細(xì)胞抽提試劑盒(Sigma公司)提取細(xì)胞蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific)測定蛋白的濃度。用10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Bio-Rad, USA)。5%脫脂牛奶液中封閉，在4℃條件下加入相應(yīng)的一抗孵育過夜，一抗包括Notch1，CyclinA1，CDK2，PCNA和P21CIPI(Bioss生物技術(shù)有限公司)，一抗孵育完后用三羥甲基氨基甲烷緩沖液中含0.1% Tween-20(TBST)清洗三次后將膜置于含對應(yīng)二抗的TBST中，室溫孵育1 h。孵育完后清洗，最后將PVDF膜置于Super ECL Plus 超敏發(fā)光液中2 min，避光進(jìn)行曝光顯影定影處理。結(jié)果用Image-Pro Plus軟件(6.0版本)對目標(biāo)蛋白條帶的密度進(jìn)行分析。

1.8 ELISA檢測基質(zhì)金屬蛋白酶活性

Rg5不同濃度治療細(xì)胞后取上清液進(jìn)行ELISA檢測基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9。實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒廠家說明進(jìn)行(上海仁捷生物有限公司)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg3和Rg5對胃細(xì)胞及正常胃粘膜細(xì)胞增值的影響

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度的人參皂苷Rg3和Rg5處理胃癌細(xì)胞株AGS、MKN-45 24 h后，對卵巢癌細(xì)胞增殖有抑制的作用，且呈劑量依賴性。但是對人正常胃粘膜細(xì)胞GES-1沒有明顯的毒副作用(表1)。Rg3對AGS和MKN-45 的IC50值分別為(33.93±1.14)μmol/L和(28.05±0.90)μmol/L。Rg5對AGS和MKN-45 的IC50值分別為(29.41±1.84)μmol/L和(22.50±1.60)μmol/L。MNK-45細(xì)胞是兩種細(xì)胞系中最敏感的癌細(xì)胞。Rg5對兩種胃癌細(xì)胞株的抗癌活性均明顯強(qiáng)于Rg3(P<0.05)。因此本研究通過Rg5繼續(xù)研究其抗胃癌的機(jī)制。

Tab. 1 The cell viabilities of MKN-45, AGS and GES-1 cells treated with various concentrations of Rg3 and Rg5 for 24 h

*P<0.05vsRg3

2.2 人參皂苷Rg5對胃癌細(xì)胞MNK-45周期的影響

為了驗(yàn)證Rg5是否通過周期阻滯來抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，本研究通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，通過觀察細(xì)胞周期中哪一期細(xì)胞比例增多來直接反映細(xì)胞停滯在相應(yīng)的周期。如圖1實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物處理24 h后，相對于對照組，Rg5可以使胃癌細(xì)胞MNK-45 停滯在S期使其的積累顯著性增多。當(dāng)Rg5濃度為20 μmol/L時(shí)，MNK-45細(xì)胞S期比例由對照組的(15.48±2.44)%上升到(37.84±1.58)%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Rg5治療可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生S期阻滯。

Fig. 1 Effect of Rg5 on cell cycle distribution of MNK-45 cell

A: Cell cycle distribution was examined by flow cytometry; B: Statistical analysis of S phase rates

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs5 μmol/L group;▲▲P<0.01vs10 μmol/L group

2.3 人參皂苷Rg5抑制胃癌細(xì)胞侵襲

絕大多數(shù)癌癥患者死于腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究通過Tranwell小室檢測了Rg5對胃癌細(xì)胞的侵襲的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2顯示了加入0, 5, 10, 20 μmol/L Rg5后胃癌細(xì)胞的侵襲能力。如圖2所示，當(dāng)Rg5濃度為20 μmol/L時(shí)，與對照組相比侵襲細(xì)胞顯著性減少。

Fig. 2 Rg5 inhibited gastric cancer cell invasion

A: MKN-45 cells were treated with Rg5 24 h.Cells were collected and seeded in the up-chamber of transwell system coated with Matrigel(×200); B：Quantification of(A)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs5 μmol/L group;▲▲P<0.01vs10 μmol/L group

2.4 人參皂苷Rg5抗胃癌機(jī)制的研究

由于Notch1在多種惡性腫瘤中均被檢測出表達(dá)量異常，本研究通過WB檢測Notch1以及受該通路調(diào)控的周期相關(guān)蛋白CyclinA1，CDK2，PCNA和P21CIPI以及通過ELISA檢測侵襲相關(guān)蛋白金屬基質(zhì)蛋白酶MMP2和MMP9來驗(yàn)證Rg5是否通過調(diào)控Notch1蛋白從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生S期阻滯和抑制胃癌細(xì)胞侵襲。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3A所示，隨著Rg5濃度的升高，Notch1蛋白顯著性降低。Rg5可以下調(diào)調(diào)控細(xì)胞周期S期的相關(guān)蛋白復(fù)合體CyclinA1/CDK2/PCNA(圖3B)及上調(diào)P21CIPI蛋白的表達(dá)。ELISA結(jié)果如表2所示，侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)隨著人參皂苷Rg5的濃度的增加其表達(dá)下降。

GroupMMP2 MMP9 Control30.22±1.4566.03±1.56aRg5(5μmol/L)27.19±1.2963.54±1.00Rg5(10μmol/L)19.78±0.87??##55.81±0.68??##Rg5(20μmol/L)12.53±0.68??##▲▲50.55±0.83??##▲▲

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs5 μmol/L group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vs10 μmol/L group

Fig. 3 Effects of Rg5 on the expression of Notch1(A)and cycle-related proteins(B)

3 討論

人參皂苷Rg3已被證實(shí)是相對安全的藥物，在體內(nèi)和體外癌癥模型中有著顯著的抗癌活性[5]。前期研究表明人參皂苷Rg3能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減弱細(xì)胞遷移和侵襲，增強(qiáng)癌細(xì)胞對化療的敏感性。Rg5的抗癌作用研究較少，先前的一項(xiàng)研究表明與人參皂苷Rg3相比，Rg5具有多途徑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用[6]。但是Rg3和Rg5在胃癌中的研究較少且機(jī)制尚不明確，本研究發(fā)現(xiàn)Rg5表現(xiàn)出比Rg3更強(qiáng)的抗癌活性且對正常胃粘膜細(xì)胞無毒副作用，因此Rg5可能成為改善胃癌的一種有效的天然新物質(zhì)。

作為一種上游信號通路，Notch的激活已被報(bào)道在許多癌癥中。越來越多的證據(jù)表明Notch1在胃癌組織中異常活化并高度表達(dá)。Notch1在胃癌中起重要的腫瘤進(jìn)展作用[7]。研究表明植物化學(xué)物質(zhì)可以通過調(diào)節(jié)癌癥中異常的信號通路參與癌癥的治療與化學(xué)預(yù)防。張等[8]發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠通過提高細(xì)胞和體液免疫、減輕炎癥反應(yīng)抑制乳腺癌細(xì)胞的生長。先前研究表明Rg5通過抑制PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡和自噬[9]。抑制Notch1可以誘導(dǎo)PTEN磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G2/M周期阻滯[10]。有研究發(fā)現(xiàn), 通過激活Notch1信號通路, 可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激有關(guān)的生理活動(dòng), 進(jìn)而發(fā)揮對心臟的保護(hù)作用[11]。在本研究中發(fā)現(xiàn)Rg5在胃癌細(xì)胞MNK-45中通過抑制Notch1蛋白的表達(dá)胃癌細(xì)胞發(fā)生周期阻滯和抑制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯是抑制癌細(xì)胞生長的有效方法，調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，尤其是細(xì)胞周期蛋白、CDKs和CDK抑制劑的表達(dá)，在抑制腫瘤生長中起著至關(guān)重要的作用[12]。有證據(jù)表明PCNA、P21、CyclinA1和CDK2是導(dǎo)致S期細(xì)胞阻滯的原因[13]。以往的研究表明，人參皂苷能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。人參皂苷Rh2通過下調(diào)CyclinD1和CDK4，誘導(dǎo)A549人肺腺癌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞周期阻滯[14]。人參皂苷Rf通過線粒體途徑誘導(dǎo)MG63人骨肉瘤細(xì)胞G2/M期細(xì)胞周期阻滯和凋亡[15]。還有研究發(fā)現(xiàn)Notch1促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的重要原因。因此，開發(fā)針對侵襲轉(zhuǎn)移的新治療方法具有重要意義。先前研究發(fā)現(xiàn)Rg1可以通過調(diào)控NF-κB抑制MMP9表達(dá)從而抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[17]。在本研究中發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg5能有效抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。人參皂苷Rg5通過抑制MMP-2和MMP-9的蛋白來抑制其的分泌，由于MMP-2和MMP-9被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移功能的關(guān)鍵調(diào)控因子，因此人參皂苷Rg5對侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用可能是通過抑制MMP-2和MMP-9介導(dǎo)的。

綜上所述，與Rg3相比，人參皂苷Rg5有較強(qiáng)的抗胃癌活性，其能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生S期阻滯并抑制其遷移，作用機(jī)制可能是通過調(diào)控Notch1蛋白的下調(diào)而發(fā)揮作用。