高玉錄，仝亞軍，張成超，孫永江，杜遠(yuǎn)鵬，翟 衡

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，泰安 271018）

我國(guó)鹽漬土資源量多且分布廣泛，鹽堿地的改良利用是涉及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大問(wèn)題，目前耐鹽‘海水稻’已經(jīng)進(jìn)入產(chǎn)業(yè)規(guī)模示范階段。葡萄是一種相對(duì)較耐鹽的果樹樹種，也是鹽堿地區(qū)農(nóng)民喜歡種植的高效經(jīng)濟(jì)作物之一，而葡萄砧木在抵御逆境、病蟲等方面發(fā)揮重要作用，利用砧木進(jìn)行嫁接栽培已成為葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

植物光合作用對(duì)逆境脅迫非常敏感，可以用作反映逆境脅迫的有效探針。因此，研究鹽脅迫對(duì)葡萄砧木光合作用的影響，對(duì)揭示砧木的抗鹽機(jī)制具有重要的理論意義。植物吸收的光能超過(guò)光合作用所能利用的限度而導(dǎo)致光合效率下降的現(xiàn)象叫光抑制，它包括光系統(tǒng)II（PSII）光抑制和光系統(tǒng)I（PSI）光抑制。通常認(rèn)為PSII 是逆境脅迫光抑制的主要位點(diǎn)[1]，PSII 最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）的下降是PSII 發(fā)生光抑制的重要指標(biāo)[2]。相比PSII，一般情況下PSI 不易發(fā)生光抑制，但研究表明鹽脅迫情況下PSI 卻是容易傷害位點(diǎn)[3-4]。植物環(huán)式電子傳遞（CEF）由于具有產(chǎn)生跨膜質(zhì)子梯度并只合成ATP且無(wú)還原力（NADPH）的形成的特點(diǎn)，在短期鹽脅迫過(guò)程中起到了重要作用[5]，被認(rèn)為是抵御逆境脅迫的重要防御機(jī)制[6-7]，但缺少對(duì)長(zhǎng)期鹽脅迫下葡萄CEF 活性變化觃律的報(bào)道。本研究以葡萄優(yōu)良抗性砧木‘3309C’為試材，對(duì)盆栽苗進(jìn)行澆鹽處理，模擬不同持續(xù)時(shí)間的鹽脅迫，研究了植株光合特性對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，以期為葡萄抗鹽栽培提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗(yàn)于2017 年4—9 月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站葡萄園基地內(nèi)進(jìn)行，選取葡萄砧木品種‘3309C’1 年生苗為試驗(yàn)材料，春季種植到觃格為外口直徑23.5 cm、內(nèi)口直徑20.1 cm、高14.0 cm、底部直徑12.9 cm 的塑料盆中，基質(zhì)為中性壤土、沙及有機(jī)肥按照的比例配制而成，待生長(zhǎng)到6～7 片葉片時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，用濃度為100 mmolL 的NaCl 溶液澆灌植株，每株澆1 L，每隔2 d 澆灌1 次，對(duì)照澆等量清水，每3 株為1個(gè)處理，重復(fù)3 次。

分別在澆灌處理前、處理7 d（澆灌4 次）和處理14 d（澆灌8 次）選擇中部節(jié)位長(zhǎng)勢(shì)一致的葉片進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定。

1.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

使用連續(xù)激發(fā)式熒光儀（Handy PEA，Hansatech，英國(guó)）測(cè)定暗適應(yīng)下的葉片快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線。Fo為最小熒光（20 μs）；Fk為K 點(diǎn)（300 μs）的熒光；FJ為J 點(diǎn)（2 ms）的熒光；Fm為最大熒光即P 點(diǎn)的熒光。通過(guò)JIP-test 分析可得到如下參數(shù)：

使用Dual-PAM100 葉綠素?zé)晒鈨x（Walz，Germany）進(jìn)行處理的活體測(cè)定。首先對(duì)經(jīng)過(guò)一晚上暗適應(yīng)的葉片進(jìn)行Fm的測(cè)定，然后將葉片置于471 μmol·m-2·s-1的光下進(jìn)行充分光啟動(dòng)后測(cè)定光下熒光參數(shù)：

Y（II）表示PSII 的有效量子產(chǎn)率，Y（NPQ）和Y（NO）分別表示PSII 中調(diào)節(jié)和非調(diào)節(jié)能量耗散的量子產(chǎn)額，Y（NA）和Y（ND）分別表示由于PSI電子受體側(cè)和供體側(cè)限制引起的非光化學(xué)能量耗散的量子產(chǎn)額。Fm′表示光適應(yīng)后的最大熒光，F(xiàn)s是光適應(yīng)后的穩(wěn)態(tài)熒光，Pm為最大光氧化P700，Pm′表示光下PSI 最大熒光。

β/α-1 表示PSI 和PSII 間激發(fā)能分配的不平衡性[8]。

作用光關(guān)閉后葉綠素?zé)晒馑矔r(shí)上升測(cè)定：同樣使用Dual-PAM 100 葉綠素?zé)晒鈨x進(jìn)行作用光關(guān)閉后葉綠素?zé)晒馑矔r(shí)上升的測(cè)定。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的經(jīng)過(guò)30 min 暗適應(yīng)的葉片，測(cè)定開始后，先用小于0.1 μmol·m-2·s-1的調(diào)制測(cè)量光測(cè)定暗中最小熒光，然后再用大于7 000 μmol·m-2·s-1測(cè)定最大熒光，接著再用200 μmol·m-2·s-1活化光，此時(shí)熒光信號(hào)會(huì)隨時(shí)間逐漸衰減，3 min 后關(guān)閉活化光，熒光信號(hào)降低后再次瞬時(shí)上升，同時(shí)繼續(xù)記錄此時(shí)熒光信號(hào)的變化。

P700+再還原速率的測(cè)定：利用Dual-PAM 100葉綠素?zé)晒鈨x進(jìn)行葡萄葉片P700+再還原速率的測(cè)定，經(jīng)過(guò)30 min 暗適應(yīng)的植物被遠(yuǎn)紅光（＞705 nm，5.2 μmol·m-2·s-1）照射使P700+充分氧化，經(jīng)過(guò)30 s 照射后，熒光信號(hào)充分平穩(wěn)。然后再關(guān)閉遠(yuǎn)紅光使P700+再還原，并記錄P700+再還原曲線的速率和時(shí)間，計(jì)算其半衰期（T1/2）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行LSD 多重比較。用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及作圖，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)PSII 及PSI 活性的影響

PSII 最大光化學(xué)效率可以反映PSII 受脅迫程度。從圖1 可以看出，與對(duì)照相比，100 mmol/L 的NaCl 溶液處理到第7 d 時(shí)Fv/Fm開始出現(xiàn)降低，比對(duì)照下降了4.3%，第14 d 時(shí)出現(xiàn)顯著下降，相比對(duì)照下降了13.6%。最大光氧化P700 可以反映PSI 活性，由圖2 可知，脅迫處理第7 d 便導(dǎo)致了Pm值出現(xiàn)了顯著降低，相比對(duì)照下降了14.7%，第14 d 下降了41.3%。上述結(jié)果表明，鹽脅迫抑制了葡萄葉片PSII 和PSI 活性，而相比PSII，‘3309C’葉片PSI的鹽脅迫耐受能力較弱。

圖1 鹽脅迫對(duì)葡萄砧木葉片PSII 最大光化學(xué)效率的影響

圖2 鹽脅迫對(duì)葡萄砧木葉片最大光氧化P700 的影響

2.2 鹽脅迫對(duì)葉綠素?zé)晒馇€及參數(shù)的影響

通過(guò)分析葉綠素?zé)晒舛囗?xiàng)上升動(dòng)力學(xué)曲線可以獲得與光合原初反應(yīng)有關(guān)的豐富信息。從圖3 可以看出，隨著鹽脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄砧木葉片O-J-I-P 曲線發(fā)生變化。長(zhǎng)期鹽脅迫導(dǎo)致葉片熒光曲線發(fā)生明顯變化，F(xiàn)m值發(fā)生明顯降低，說(shuō)明鹽脅迫下葉片單位面積吸收的光能明顯降低。

圖3 鹽脅迫下葡萄砧木葉片不同時(shí)間段穩(wěn)態(tài)熒光變化

對(duì)植物快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的分析，可以獲得大量關(guān)于PSII 原初光化學(xué)反應(yīng)的信息。K 點(diǎn)相對(duì)可變熒光（Wk）可以表示PSII供體側(cè)放氧復(fù)合體的受傷害程度。由圖4 可以看出，隨著鹽處理時(shí)間的增加，Wk值也在逐漸升高，到第14 d 有顯著升高，上升幅度為14.8%，表明葡萄葉片PSII 供體側(cè)受到了鹽脅迫的傷害。而單位面積有活性反應(yīng)中心數(shù)量（RC/CSm）及捕獲的電子傳遞至QA以后的概率（ΨEo）在處理至第7 d 時(shí)較對(duì)照都有所降低，下降的幅度分別為7.5%、14.3%，第14 d出現(xiàn)顯著下降，下降幅度分別為45.4%、30.3%（圖5、6）。這都表明鹽脅迫傷害了PSII 光合電子傳遞鏈。

圖4 鹽脅迫對(duì)葡萄砧木葉片K 點(diǎn)相對(duì)可變熒光的影響

圖5 鹽脅迫對(duì)單位面積活性反應(yīng)中心數(shù)量的影響

圖6 鹽脅迫對(duì)捕獲的電子傳遞至QA以后的概率的影響

2.3 鹽脅迫對(duì)光系統(tǒng)能量分配的影響

鹽脅迫改變了PSII 和PSI 的能量分配。由圖7可知，隨著鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng)，PSII 可調(diào)節(jié)的熱耗散Y（NPQ）逐漸升高，第14 d 與對(duì)照相比差異顯著，上升了12.3%；而不可調(diào)節(jié)的熱耗散Y（NO）雖有所上升但差異不顯著，表明PSII 活性受到了抑制。與此同時(shí)，PSI 氧化態(tài)P700 即Y（ND）逐漸降低，第14 d 與對(duì)照相比差異顯著，下降了12.3%，PSI 供體側(cè)受抑制程度明顯增加，而還原態(tài)P700+即Y（NA）逐漸升高，第7 d 即出現(xiàn)顯著升高，升高了23.5%，第14 d 相比對(duì)照升高了127.3%，說(shuō)明PSI 受體側(cè)受抑制程度明顯增加，進(jìn)一步表明鹽脅迫導(dǎo)致了PSI 光抑制的發(fā)生。

圖7 鹽脅迫對(duì)葡萄砧木葉片PSII 和PSI 光能利用效率的影響

利用PSII 熒光產(chǎn)量進(jìn)一步分析2 個(gè)光系統(tǒng)之間的激發(fā)能分配，從圖8 可以看到，隨著鹽脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)（β/α-1）的值逐漸增大，與對(duì)照處理相比，第7、14 d 處理后分別增加了8.4%和75.8%，說(shuō)明鹽脅迫導(dǎo)致了葡萄葉片PSII 和PSI 間激發(fā)能分配不平衡性的增大。

2.4 鹽脅迫對(duì)環(huán)式電子傳遞的影響

通過(guò)檢測(cè)作用光關(guān)閉后葉綠素?zé)晒馑矔r(shí)上升可以檢測(cè)NDH 途徑的環(huán)式電子傳遞能力的大小，從圖9 可以看出，隨著鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng)，作用光關(guān)閉后的熒光上升幅度及斜率均逐漸降低，處理第7 d 就出現(xiàn)明顯下降，表明長(zhǎng)時(shí)間的鹽處理抑制了依賴NDH 途徑的CEF 活性。

圖8 鹽脅迫對(duì)葡萄砧木葉片PSII 和PSI 間激發(fā)能分配不平衡性的影響

P700+再還原動(dòng)力曲線的半衰期能反映環(huán)式電子傳遞的速率[9]，如圖10 所示，隨著鹽處理的進(jìn)行，第7 dT1/2值出現(xiàn)了顯著升高，比對(duì)照升高了11.2%，第14 d 比對(duì)照升高了30.7%，結(jié)果進(jìn)一步表明長(zhǎng)時(shí)間鹽處理抑制了葡萄CEF 的活性。

圖9 鹽脅迫作用光關(guān)閉后葉綠素?zé)晒馑矔r(shí)曲線

圖10 鹽脅迫對(duì)P700+再還原動(dòng)力曲線半衰期的影響

3 討論與結(jié)論

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器，對(duì)葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行分析能夠反映脅迫條件下植物光合器官的傷害程度。光合機(jī)構(gòu)由PSI 和PSII組成，當(dāng)植物吸收的光能超過(guò)所能利用的光能時(shí)，過(guò)剩光能便會(huì)導(dǎo)致光合機(jī)構(gòu)的光抑制，甚至造成光破壞[10]。研究表明氯化鈉鹽脅迫導(dǎo)致葉綠素發(fā)生降解[11]，引起植物光系統(tǒng)活性發(fā)生抑制[4,10,12]。本研究中，隨著氯化鈉鹽處理時(shí)間的增加，葉片最大光化學(xué)效率及最大光氧化P700 均逐漸降低，且最大光化學(xué)效率發(fā)生降低時(shí)間早于最大光氧化P700，表明鹽脅迫抑制了葡萄葉片光系統(tǒng)活性，其中PSI 相比PSII 更容易受到鹽脅迫的抑制，這與顏坤等[13]在金銀花上的研究結(jié)果一致。

光合作用的高效率進(jìn)行依賴于PSII 和PSI 的協(xié)調(diào)運(yùn)轉(zhuǎn)，從而確保光合色素吸收的光能在2 個(gè)光系統(tǒng)間的均衡分配[10]。鹽脅迫下葉片2 個(gè)光系統(tǒng)間激發(fā)能分配失衡，葉片不能通過(guò)狀態(tài)轉(zhuǎn)換有效地將吸收的光能從PSII 傳遞給PSI，導(dǎo)致了葡萄葉片K 點(diǎn)相對(duì)可變熒光逐漸升高，而用于電子傳遞量子產(chǎn)額、單位面積有活性反應(yīng)中心的數(shù)量均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，表明鹽脅迫抑制了葡萄葉片PSII 供體側(cè)和受體側(cè)導(dǎo)致PSII 電子傳遞受到抑制。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片可調(diào)節(jié)的能量耗散Y（NPQ）逐漸升高，一方面表明其接受的光強(qiáng)過(guò)剩，另一方面說(shuō)明葉片啟動(dòng)了與高能態(tài)淬滅有關(guān)的葉黃素循環(huán)過(guò)程并不能耗散掉所有的光能，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，過(guò)剩光能的比例越來(lái)越高，非調(diào)節(jié)性能量耗散Y（NO）逐漸升高，葉片發(fā)生嚴(yán)重光抑制[14]。

研究表明圍繞PSI 的環(huán)式電子傳遞在逆境脅迫下對(duì)穩(wěn)定PSI 活性起到了重要的作用，進(jìn)而有助于PSII 的保護(hù)和修復(fù)[15]。植物體內(nèi)CEF 主要起到了2方面作用：通過(guò)NPQ 進(jìn)行熱耗散[16-17]以及提供ATP進(jìn)行CO2固定[18]。作用光關(guān)閉后熒光瞬時(shí)上升能夠反映依賴NDH途徑的CEF的活性[19]，研究發(fā)現(xiàn)NDH途徑在光保護(hù)過(guò)程中起重要作用[20]，能夠減輕逆境脅迫下葉綠體ROS 的積累及基質(zhì)的過(guò)度還原[21]。隨著鹽脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄葉片葉綠素?zé)晒馑矔r(shí)上升幅度和斜率均降低，表明長(zhǎng)時(shí)間的鹽處理抑制了NDH 途徑。P700+再還原速率可以用來(lái)反映CEF 活性[22]。本研究中，鹽脅迫下伴隨光抑制的加劇，P700+再還原動(dòng)力曲線的半衰期逐漸增大，這些結(jié)果說(shuō)明長(zhǎng)期鹽脅迫下，CEF 活性的抑制可能是導(dǎo)致能夠通過(guò)對(duì)葉綠體基質(zhì)的過(guò)度還原，增加ROS 的累積，加劇光抑制程度。長(zhǎng)期鹽脅迫導(dǎo)致葡萄砧木2 個(gè)光系統(tǒng)激發(fā)能分配嚴(yán)重偏離平衡狀態(tài)，抑制了光系統(tǒng)活性，更多的能量被用來(lái)進(jìn)行熱耗散，而圍繞PSI 的環(huán)式電子傳遞活性的抑制則進(jìn)一步加劇了葡萄葉片光系統(tǒng)光抑制程度。