陳 偉，于文文，2，陳亞軍，徐 彬，滕 云

（1.浙江海正藥業(yè)股份有限公司 浙江省抗真菌藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臺州 318000；2.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310000）

青蒿素是現(xiàn)今針對瘧疾相關(guān)疾病最為有效的藥物[1-2]，青蒿素及其相關(guān)的系列衍生物在抗炎、預(yù)防及提高人類自身免疫等方面也具有一定的積極效果[3]，因此在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景較為廣闊[4]。青蒿素可以通過三種不同的方法進(jìn)行制備與獲得，分別是從種植的黃花蒿中提取[5-6]、全化學(xué)合成[7-8]以及利用基因工程手段構(gòu)建可產(chǎn)青蒿酸的微生物，通過發(fā)酵獲得青蒿酸，然后再經(jīng)過化學(xué)合成獲得[9]。

PADDON C J等[10-14]首創(chuàng)了青蒿酸的微生物發(fā)酵技術(shù)，通過基因改造技術(shù)得到直接產(chǎn)青蒿酸的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）工程菌，并通過系列優(yōu)化，不斷提高青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量。王冬等[15]研究發(fā)現(xiàn)，青蒿酸的發(fā)酵制備存在成本偏高的問題。目前，國內(nèi)的研究主要集中在通過對菌種的基因工程改造，實(shí)現(xiàn)青蒿酸前體-紫橞槐二烯的微生物合成，但尚未實(shí)現(xiàn)青蒿酸的體內(nèi)合成[16-17]。于文文等[18]在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化確定了S.cerevisiae工程菌1211產(chǎn)青蒿酸較為適宜的發(fā)酵工藝并提高了青蒿酸的產(chǎn)量。本研究首先在50 L發(fā)酵罐中對S.cerevisiae工程菌1211發(fā)酵產(chǎn)青蒿酸的溶氧參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在確定最佳溶氧水平的基礎(chǔ)上，對S.cerevisiae工程菌1211分批發(fā)酵過程中菌體生長、青蒿酸合成以及基質(zhì)消耗隨發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律進(jìn)行分析，明確發(fā)酵過程中基質(zhì)濃度變化對釀酒酵母工程菌1211代謝以及青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響。在此基礎(chǔ)上，利用Logistic方程和Luedeking-Piret方程，研究S.cerevisiae工程菌1211發(fā)酵過程變化規(guī)律，建立S.cerevisiae工程菌1211產(chǎn)青蒿酸分批發(fā)酵動力學(xué)模型，為發(fā)酵過程的預(yù)測和控制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

釀酒酵母（S.cerevisiae）工程菌1211：保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

葡萄糖（分析純）：山東西王糖業(yè)有限公司；蔗糖、琥珀酸、KH2PO4、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、CuSO4·5H2O、生物素、泛酸鈣、煙酸、肌醇、維生素B1、吡哆醛、對氨基苯甲酸、ZnSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、CoCl2·6H2O、NaMoO4·2H2O、CaCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基[18]：葡萄糖19.5 g/L，KH2PO48 g/L，（NH4）2SO415 g/L，MgSO4·7H2O 6.2 g/L，維生素溶液12 mL/L，金屬離子溶液10 mL/L，CuSO4·5H2O 40 μg/L，琥珀酸緩沖液（0.5 mol/L，pH 5.0）100 mL/L。

固體培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加20 g/L瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基[18]：蔗糖91.8 g/L，KH2PO48.7 g/L，（NH4）2SO410.3 g/L，MgSO4·7H2O 6.2 g/L，維生素溶液12 mL/L，金屬離子溶液10 mL/L，CuSO4·5H2O 24 mg/L。

以上培養(yǎng)基在121 ℃條件下滅菌25 min。

1.2 儀器與設(shè)備

15 L發(fā)酵罐和50 L發(fā)酵罐：上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司；JH3102稱量天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；ZWYR-C2112C型雙層真彩觸摸屏搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；1290型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Agilent公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；M-100型生物傳感器分析儀：深圳西爾曼科技有限公司；SL 40型臺式離心機(jī)：美國Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵罐培養(yǎng)方法

菌株的活化、搖瓶一級種子培養(yǎng)制備：參照文獻(xiàn)[18]。

15 L種子罐中S.cerevisiae工程菌1211種子的擴(kuò)大培養(yǎng)：裝液量8 L/15 L，發(fā)酵溫度30 ℃，菌種接種量10%（V/V），通氣比1.0 vvm，起始攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵溶氧（dissolved oxygen，DO）≥35%，溶氧＜35%時(shí)，系統(tǒng)自動提高攪拌轉(zhuǎn)速，最高攪拌轉(zhuǎn)速≤800r/min，以維持溶氧＞35%，培養(yǎng)周期24h。

50 L發(fā)酵罐中S.cerevisiae工程菌1211的發(fā)酵培養(yǎng)：裝液量20 L/50 L，培養(yǎng)溫度30 ℃，菌種接種量10%（V/V），起始攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，攪拌轉(zhuǎn)速的設(shè)定范圍為200～450 r/min，發(fā)酵過程中通過流加28%氨水使培養(yǎng)基的pH值維持在5.5，通氣比1.6 vvm，發(fā)酵周期96 h。

1.3.2 溶氧對釀酒酵母工程菌1211發(fā)酵產(chǎn)青蒿酸的影響

S.cerevisiae工程菌1211發(fā)酵制備青蒿酸過程中，溶氧是最為關(guān)鍵的參數(shù)。菌體在生長代謝過程中，菌體的生長代謝和目標(biāo)產(chǎn)物的積累很大程度上受限于菌體所在發(fā)酵罐內(nèi)溶氧水平的高低。采用溶氧與轉(zhuǎn)速聯(lián)動，固定空氣進(jìn)氣量，考察不同溶氧水平（10%～15%、15%～20%、20%～25%、25%～30%、30%～35%、35%～40%）對S.cerevisiae工程菌1211的生長和青蒿酸產(chǎn)量的影響。

1.3.3 生物量測定

OD600nm值：采用紫外分光光度計(jì)在波長600 nm處測定發(fā)酵液的吸光度值。

細(xì)胞干質(zhì)量：取發(fā)酵液10mL于15mL離心管中，3000r/min離心15 min，棄去上清液，使用去離子水重復(fù)洗滌3次，最終獲得的濕菌體放入80 ℃的烘箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。

1.3.4 殘?zhí)橇康臏y定

發(fā)酵液經(jīng)3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（evaporative light scattering detection，ELSD）測定殘?zhí)牵ㄕ崽牵┖縖19]。

1.3.5 青蒿酸產(chǎn)量的測定

樣品前處理：取1 mL待測發(fā)酵液樣品和9 mL甲酸甲醇溶液（甲醇溶液中加入0.5%（V/V）純度為98%的甲酸）置于10 mL試管，充分混合均勻后，在超聲溫度45～50 ℃、功率200 W的條件下超聲破碎30 min，取混合液1 mL，12 000 r/min高速離心5 min，取上清液經(jīng)0.2 μm膜過濾獲得待測樣品。

青蒿酸含量：采用高效液相色譜法進(jìn)行測定[18]。

1.3.6 動力學(xué)模型的建立

（1）S.cerevisiae工程菌1211生長動力學(xué)模型的建立

因S.cerevisiae工程菌1211的生長曲線為較標(biāo)準(zhǔn)的S型生長曲線，故選擇Logistic方程（式（1））[20-21]擬合菌體的生長規(guī)律。

式中：dX/dt為S.cerevisiae工程菌1211生長繁殖的速度，g/（L·h）；μm為S.cerevisiae工程菌1211菌體的最大比生長速率，h-1；X為S.cerevisiae工程菌1211的生物量，g/L；Xm為S.cerevisiae工程菌1211的最大生物量，g/L；t為相應(yīng)的發(fā)酵時(shí)間，h。下同。

將Logistic方程通過積分處理，獲得相應(yīng)的代數(shù)方程，見式（2）。

式中：X0為S.cerevisiae工程菌1211的初始菌體生物量，g/L。

（2）青蒿酸合成動力學(xué)模型的建立

采用Luedeking-Piret方程[22]對菌體的生長繁殖與目標(biāo)產(chǎn)物的積累之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行描述，其方程式見式（3）。

式中：dP/dt為青蒿酸發(fā)酵積累的速度，g/（L·h）；P為青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量，g/L；α為生長偶聯(lián)系數(shù)；β為非生偶聯(lián)系數(shù)。

其中，α≠0、β=0表示為生長相關(guān)型；α≠0、β≠0表示為生長部分相關(guān)型；α=0、β≠0表示為非生長相關(guān)型。結(jié)合公式（2）和公式（3），對Luedeking-Piret方程進(jìn)行積分處理，得到相應(yīng)的代數(shù)方程，見式（4）。

式中：P0為青蒿酸初始產(chǎn)量，g/L。由于青蒿酸初始含量為0，因此P0可忽略不計(jì)。

（3）基質(zhì)消耗動力學(xué)模型的建立[23-24]

碳源基質(zhì)的消耗可以由類似Luedeking-Piret的式（5）來表示。

式中：dS/dt為基質(zhì)（碳源）消耗的速度，g/（L·h）；S為發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的質(zhì)量濃度，g/L；YX/S為發(fā)酵碳源用于S.cerevisiae工程菌1211菌體生長的得率常數(shù)；YP/S為發(fā)酵碳源用于目標(biāo)產(chǎn)物青蒿酸積累得率常數(shù)；m為S.cerevisiae工程菌1211菌體維持系數(shù)。

將式（1）、式（3）和式（5）進(jìn)行積分換算得式（6）。

式中：S0為初始碳源質(zhì)量濃度，g/L；λ=1/YX/S；ω=1/YP/S。

1.3.7 動力學(xué)模型的驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)所獲得的發(fā)酵模型是否準(zhǔn)確可靠，在發(fā)酵培養(yǎng)條件相同的前提下，進(jìn)行3個(gè)批次的平行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，將發(fā)酵培養(yǎng)獲得的實(shí)際實(shí)驗(yàn)值與通過建模得到的模型預(yù)測值進(jìn)行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶氧對釀酒酵母工程菌1211發(fā)酵產(chǎn)青蒿酸的影響

不同溶氧水平對S.cerevisiae工程菌1211的生長和青蒿酸產(chǎn)量的影響見圖1。

由圖1a可知，在發(fā)酵前期，不同溶氧水平條件下，S.cerevisiae工程菌1211的OD600nm值差異不大；到發(fā)酵中期時(shí)，OD600nm值的差異逐漸變大；再到發(fā)酵后期，OD600nm值均趨于穩(wěn)定或略有下降。溶氧越高，OD600nm值越高，S.cerevisiae工程菌1211的初級代謝越旺盛。由此可知，溶氧水平對S.cerevisiae工程菌1211的生長繁殖有著顯著的影響，足夠的溶氧可以明顯提高S.cerevisiae工程菌1211的生物量，大量的氧氣被用于菌株的繁殖生長代謝。

由圖1b可知，當(dāng)溶氧處于10%～15%時(shí)，S.cerevisiae工程菌1211的青蒿酸產(chǎn)量較低，為（3 351.2±60.4）mg/L，分析原因可能是由于S.cerevisiae工程菌1211產(chǎn)青蒿酸需要通過甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA），而該途徑需要消耗大量的能量，此時(shí)，發(fā)酵體系中沒有足夠的氧氣支持菌株進(jìn)行呼吸作用，進(jìn)而導(dǎo)致青蒿酸產(chǎn)量較低。當(dāng)溶氧升高至25%～30%時(shí)，青蒿酸的發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到最高，為（6 269.6±100.3）mg/L。之后隨著溶氧水平的進(jìn)一步提高，青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量出現(xiàn)下降。分析原因可能是由于高溶氧條件下，菌株的初級代謝非常旺盛，與產(chǎn)青蒿酸途徑在利用碳源等基質(zhì)的情況下形成了競爭關(guān)系。當(dāng)溶氧為35%～40%時(shí)，青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量下降至（4 154.4±124.6）mg/L。因此，選擇溶氧水平25%～30%為50 L發(fā)酵罐的最適溶氧條件。

圖1 不同溶氧對釀酒酵母工程菌1211生長（a）及青蒿酸產(chǎn)量（b）的影響Fig.1 Effect of dissolved oxygen on growth(a)and arteannuic acid yield(b)of engineered Saccharomyces cerevisiae 1211

2.2 釀酒酵母工程菌1211分批發(fā)酵產(chǎn)青蒿酸過程

圖2 50 L發(fā)酵罐中釀酒酵母工程菌1211分批發(fā)酵過程Fig.2 Batch fermentation process of engineered Saccharomyces cerevisiae 1211 cultivated in a 50 L fermenter

由圖2可知，S.cerevisiae工程菌1211生長的延滯期為0～12 h，菌體生長繁殖處于起始階段，發(fā)酵液中碳源消耗較少；對數(shù)生長期為12～48 h，菌體生長繁殖速度較快，發(fā)酵液中碳源消耗速度大幅上升。為了實(shí)現(xiàn)較高的菌體生物量，以提高青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量，選擇在對數(shù)中后期，即培養(yǎng)34 h時(shí)，加入乳糖水解液誘導(dǎo)S.cerevisiae工程菌1211產(chǎn)青蒿酸。平穩(wěn)期為48～84 h，這一時(shí)期菌體的生物量以較緩慢的速率增加，青蒿酸則積累迅速。衰亡期84～96 h，在此階段，菌體大量衰亡，此時(shí)菌體的死亡速率超過菌體的生長繁殖速率，導(dǎo)致菌體活細(xì)胞數(shù)呈相應(yīng)的下降趨勢，同時(shí)青蒿酸合成速率減慢。至發(fā)酵結(jié)束時(shí)，菌體生物量為44.12 g/L，殘?zhí)橇拷咏?，青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量為6.21 g/L。由此可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中，青蒿酸的合成與S.cerevisiae工程菌1211生長變化趨勢一致，說明S.cerevisiae工程菌1211的菌體生長繁殖規(guī)律與其目標(biāo)產(chǎn)物青蒿酸積累之間呈現(xiàn)出生長相關(guān)型或生長部分相關(guān)型的關(guān)系。

2.3 釀酒酵母工程菌1211菌體發(fā)酵動力學(xué)模型

2.3.1 釀酒酵母工程菌1211菌體生長模型

將圖2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入方程式（2），采用Origin 9.0進(jìn)行菌體生長模型的非線性擬合，結(jié)果見圖3。

圖3 釀酒酵母工程菌1211干質(zhì)量實(shí)驗(yàn)值與模型擬合結(jié)果的比較Fig.3 Comparison of experimental values and model fitting values of cell dry weight of engineered Saccharomyces cerevisiae 1211

由圖3可知，菌體生長模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.995 85，S.cerevisiae工程菌1211菌體生長動力學(xué)參數(shù)X0、Xm和μm值分別為0.85、45.81和0.12，獲得菌體生長動力學(xué)方程如下：

S.cerevisiae工程菌1211的生長繁殖數(shù)據(jù)得到的動力學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)值擬合較好。特別是在菌體的發(fā)酵前中期，發(fā)酵實(shí)驗(yàn)值與已建立的動力學(xué)模型擬合曲線較為一致，但是到了發(fā)酵末期，由于發(fā)酵罐中的青蒿酸含量逐漸升高，對菌體的生長有一定的抑制，從而使得菌體生物量相對于擬合值有所偏差。

2.3.2 釀酒酵母工程菌1211青蒿酸合成動力學(xué)模型

根據(jù)圖2得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，將S.cerevisiae工程菌1211菌體相關(guān)的生長動力學(xué)參數(shù)X0、Xm和μm值分別代入方程式（4）中，采用Origin 9.0進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果見圖4。

圖4 青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)值與模型擬合結(jié)果的比較Fig.4 Comparison of experimental values of artemisinic acid yield with calculated values by model

由圖4可知，青蒿酸合成動力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.979 04，得到青蒿酸合成動力學(xué)參數(shù)α=0.074、β=0.001 1，由此可知，S.cerevisiae工程菌1211菌體在50 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)，菌體生長過程中青蒿酸的積累與菌體生長繁殖為部分生長偶聯(lián)型，從而獲得青蒿酸積累的動力學(xué)方程如下：

通過數(shù)據(jù)建模得到的青蒿酸合成動力學(xué)模型曲線與經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)獲得的實(shí)驗(yàn)值之間的擬合情況較好。在發(fā)酵合成產(chǎn)物前期，青蒿酸合成擬合曲線與實(shí)驗(yàn)值幾乎保持一致。但當(dāng)發(fā)酵后期，菌體逐漸進(jìn)入衰亡期，同時(shí)，菌體生長一定程度上也受到產(chǎn)物青蒿酸的抑制后，菌體產(chǎn)青蒿酸的能力也開始下降，發(fā)酵末期的青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量明顯低于模型預(yù)測值。

2.3.3 釀酒酵母工程菌1211基質(zhì)消耗動力學(xué)模型

根據(jù)圖2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，將所得的參數(shù)X0、Xm、μm、α、β值分別代入方程式（6）中，采用Origin 9.0進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果見圖5。

圖5 蔗糖含量實(shí)驗(yàn)值與模型擬合結(jié)果的比較Fig.5 Comparison of experimental values and model fitting results of sucrose content

由圖5可知，基質(zhì)消耗動力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.995 48，得到基質(zhì)消耗動力學(xué)模型參數(shù)S0=90.85、m=0.007、λ=1.21、ω=2.51，由此可知，S.cerevisiae工程菌1211菌體在50 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)，基質(zhì)消耗動力學(xué)方程如下：

蔗糖在S.cerevisiae工程菌1211發(fā)酵過程中被消耗的動態(tài)變化可以很好的由基質(zhì)消耗動力學(xué)模型曲線進(jìn)行描述?；|(zhì)的實(shí)際消耗與模型擬合稍有偏差僅發(fā)生在菌體的生長末期，蔗糖消耗速率未達(dá)到擬合曲線速率，可能與菌體生長代謝變慢、受到產(chǎn)物抑制以及產(chǎn)青蒿酸能力下降有關(guān)。

2.4 動力學(xué)模型的驗(yàn)證

由表1可知，除了發(fā)酵末期實(shí)驗(yàn)值與理論值差距較大，其他實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的平均值與模型預(yù)測值兩者之間的誤差大部分都是在±10%以下。因此，S.cerevisiae工程菌1211發(fā)酵產(chǎn)青蒿酸的過程能夠用以上發(fā)酵動力學(xué)模型來描述。

表1 模型理論值與試驗(yàn)值的比較Table 1 Comparison of theoretical value calculated by modelsand experimentalvalue

3 結(jié)論

S.cerevisiae工程菌1211在50 L發(fā)酵罐中的最佳發(fā)酵溶氧參數(shù)為25%～30%，在此條件下青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到（6 269.6±100.3）mg/L，與搖瓶產(chǎn)量相比提升了309.9%[18]。根據(jù)Logistic方程和Luedeking-Piret方程，借助Origin 9.0軟件，發(fā)現(xiàn)S.cerevisiae工程菌1211青蒿酸的合成和菌體的生長呈現(xiàn)出部分生長偶聯(lián)關(guān)系，建立了S.cerevisiae工程菌1211分批發(fā)酵高產(chǎn)青蒿酸的動力學(xué)模型，S.cerevisiae工程菌1211的菌體繁殖生長、青蒿酸合成以及基質(zhì)消耗模型擬合度R2分別達(dá)到0.995 85、0.979 04和0.995 48，較好的反映了S.cerevisiae工程菌1211發(fā)酵過程中菌體生物量、青蒿酸合成和基質(zhì)消耗隨發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律，該研究為S.cerevisiae工程菌1211產(chǎn)青蒿酸的發(fā)酵工藝后續(xù)改進(jìn)、發(fā)酵過程的放大與控制提供了一定的理論基礎(chǔ)。