梅漫莉，李國華，徐慶陽

（1.天津科技大學(xué) 代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津科技大學(xué) 天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457）

腺苷（adenosine），化學(xué)名為9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤[1]，指由腺嘌呤的N-9與D-核糖的C-1通過β糖苷鍵連接而成的化合物，其磷酸酯為腺苷酸。腺苷可直接進(jìn)入心肌經(jīng)磷酸化生成腺苷酸，參與心肌能量代謝，同時(shí)還參與擴(kuò)張冠狀血管，增加冠脈血流量[2-4]，是合成-磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的主要原料，ATP已被廣泛應(yīng)用于治療心不全、腦動(dòng)脈硬化及肌肉萎縮等疾病[5-6]。此外，腺苷還是一種抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)物，在神經(jīng)傳遞中起重要作用[7-8]。

腺苷的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）水解法和發(fā)酵法[9-10]?；瘜W(xué)合成法是以不同化學(xué)物質(zhì)為底物進(jìn)行化學(xué)合成腺苷，該方法合成腺苷存在著成本偏高，反應(yīng)繁瑣，產(chǎn)量低，收率低等一系列問題。RNA水解法是利用磷酸二酯酶水解酵母RNA，得到4種5'-核苷酸，然后進(jìn)一步水解脫磷酸，該方法的缺陷是同時(shí)會得到4種核苷物質(zhì)[11]，導(dǎo)致產(chǎn)物不易分離。而發(fā)酵法是通過選育解除了終產(chǎn)物反饋抑制的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[12]或短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）進(jìn)行直接發(fā)酵，發(fā)酵過程中提供充足的營養(yǎng)使菌體大量繁殖并生產(chǎn)腺苷。發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷成本較低，原料易得，且生產(chǎn)過程相對簡單，產(chǎn)苷效率較高，因此，在腺苷生產(chǎn)中占據(jù)絕對優(yōu)勢。日本早在七十年代就開始了腺苷發(fā)酵生產(chǎn)工藝技術(shù)的研究，并不斷取得技術(shù)上的突破，迄今已進(jìn)入大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)階段[11]。腺苷作為藥物，也首先由日本于1989年投入美國市場，隨后又在法國、比利時(shí)、英國等多個(gè)國家獲得批準(zhǔn)[13]。目前我國的腺苷生產(chǎn)方法主要依靠化學(xué)法和酶法，成本較高，污染比較嚴(yán)重，我國發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷起步較晚，僅有幾家公司可以利用直接發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷并達(dá)到工業(yè)化規(guī)模，與國外相比，我國利用發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的產(chǎn)量低，生產(chǎn)效率低[11]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，黃嘌呤和谷氨酰胺對菌株生長及產(chǎn)腺苷非常重要，當(dāng)發(fā)酵液中缺乏黃嘌呤時(shí)，菌株停止生長和產(chǎn)腺苷，只有發(fā)酵液中黃嘌呤達(dá)到一定濃度時(shí)菌體才持續(xù)生長和產(chǎn)腺苷[11]。谷氨酰胺是腺苷合成的前體物質(zhì)，為了調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中pH的變化，發(fā)酵過程中補(bǔ)加了大量的氨水，這會影響谷氨酰胺合成酶的活力，進(jìn)而影響腺苷的產(chǎn)量[11]。因此，本研究以解除了終產(chǎn)物反饋抑制的Bacillus subtilisXGL為出發(fā)菌株，從添加方式和添加量兩個(gè)方面來探究黃嘌呤和谷氨酰胺對Bacillus subtilisXGL生產(chǎn)腺苷的影響，以期找到黃嘌呤和谷氨酰胺最適添加量和最適添加方式，從而進(jìn)一步提高腺苷產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）XGL（此菌株是經(jīng)紫外誘變篩選得到的，是組氨酸和黃嘌呤缺陷型菌株）：天津科技大學(xué)代謝工程研究室。

1.1.2 化學(xué)試劑

MnSO4·H2O（分析純）：天津市化學(xué)試劑六廠；葡萄糖、MgSO4·7H2O（均為分析純）：天津市耀華化工廠；FeSO4·7H2O（分析純）：天津化學(xué)試劑三廠；KH2PO4·3H2O（分析純）：天津塘沽化學(xué)試劑廠；米漿（純度40%）：河北梅花味精集團(tuán)有限公司；黃嘌呤（純度99.9%）、L-谷氨酰胺（純度98.5%）：北京索萊寶科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基[14]：牛肉膏10 g/L，葡萄糖2 g/L，氯化鈉2.5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，黃嘌呤50 mg/L，組氨酸50 mg/L，瓊脂30 g/L。pH 7.0～7.2，121 ℃高壓滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基[15]：葡萄糖25 g/L，豆?jié)?0 g/L，酵母粉5 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，維生素B1（vitamin B1，VB1）1 mg/L，維生素H 1 mg/L，玉米干粉25 g/L（121 ℃高壓滅菌20 min），磷酸二氫鉀1.5 g/L，蛋白胨8 g/L，黃嘌呤100 mg/L，組氨酸50 mg/L。pH 6.4～6.7，115 ℃高壓滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[16]：葡萄糖100 g/L，豆?jié)?0 g/L，酵母粉25 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，VB12 mg/L，維生素H 2 mg/L，玉米干粉25 g/L（121 ℃高壓滅菌20 min），味精12 g/L，磷酸氫二鉀4.5 g/L，葡萄糖酸鈉1.5 g/L，黃嘌呤100 mg/L，組氨酸50 mg/L，氯化鈣2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 6 mg/L，硫酸錳6 mg/L。pH 7.0～7.2，115 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BIOTECH-5BG 5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；Agilent 1200高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Agilent公司；752型紫外分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌XGL的培養(yǎng)

菌種活化與擴(kuò)培：用接種環(huán)挑取斜面培養(yǎng)基保藏的菌種劃線于斜面培養(yǎng)基，32℃條件下恒溫培養(yǎng)10～12h。然后將其接種于茄形瓶培養(yǎng)基，32 ℃條件下恒溫培養(yǎng)10～12 h，待用。

種子液的制備：用無菌水沖洗茄形瓶培養(yǎng)基上的菌體，然后接種至裝有3L種子液的5 L發(fā)酵罐中，設(shè)置溫度為32℃，pH 為7.0（采用氨水調(diào)節(jié)pH值），轉(zhuǎn)速為200 r/min，通風(fēng)量為2 L/min，培養(yǎng)10～13 h。菌體量（OD600nm值）生長至15時(shí)為種子液。

菌株的發(fā)酵：按15%（V/V）的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量3L/5L，設(shè)置溫度為32℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min。發(fā)酵過程中通過自動(dòng)流加氨水調(diào)節(jié)pH，pH前期控制在7.0左右，后期控制在6.4左右。發(fā)酵過程中需要調(diào)節(jié)通風(fēng)量將溶氧前期控制在30%～40%之間，后期控制在10%～20%之間。發(fā)酵20 h后測定發(fā)酵液中的糖質(zhì)量濃度，糖質(zhì)量濃度控制在5～30 g/L之間。后續(xù)如果糖濃度偏低通過自動(dòng)流加80%的葡萄糖溶液。

1.3.2 黃嘌呤的添加時(shí)機(jī)及添加方式

黃嘌呤添加時(shí)機(jī)：發(fā)酵培養(yǎng)基中黃嘌呤的初始質(zhì)量濃度為100 mg/L，在發(fā)酵16 h或32 h時(shí)，一次性補(bǔ)加0.2 g/L的黃嘌呤。發(fā)酵過程中每隔4 h測定菌體生物量及腺苷產(chǎn)量。

黃嘌呤添加方式：發(fā)酵培養(yǎng)基中黃嘌呤的初始質(zhì)量濃度為100 mg/L，若黃嘌呤的添加方式為加入底料的方式，則在發(fā)酵培養(yǎng)基中再加入0.2 g/L的黃嘌呤。若采用一次性補(bǔ)加的方式，則在發(fā)酵16 h后一次性補(bǔ)加0.2 g/L的黃嘌呤。若采用分批次補(bǔ)加的方式，則分別在16 h、24 h、32 h、40 h、48 h、52 h時(shí)分別加入33 mg/L的黃嘌呤。若采用流加的方式，則在發(fā)酵16 h后持續(xù)流加質(zhì)量濃度為3 g/L的黃嘌呤溶液200 mL。發(fā)酵過程中每隔4 h測定菌體生物量、葡萄糖消耗速率及腺苷產(chǎn)量。

1.3.3 谷氨酰胺的添加量及添加方式

在黃嘌呤最佳添加條件下進(jìn)一步研究谷氨酰胺對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）XGL產(chǎn)腺苷的影響。

底物中谷氨酰胺添加量：分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0、3 g/L、6 g/L、9 g/L、12 g/L谷氨酰胺。發(fā)酵過程中每隔4 h測定菌體生物量、葡萄糖消耗速率及腺苷產(chǎn)量，發(fā)酵56 h計(jì)算糖苷轉(zhuǎn)化率。

谷氨酰胺流加量：在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加6 g/L的谷氨酰胺，在此基礎(chǔ)上在發(fā)酵32 h以后持續(xù)向發(fā)酵罐里流加0、3 g/L、6 g/L、9 g/L、12 g/L的谷氨酰胺。發(fā)酵過程中每隔4 h測定菌體生物量、葡萄糖消耗速率及腺苷產(chǎn)量，發(fā)酵56 h計(jì)算糖苷轉(zhuǎn)化率。

1.3.4 分析檢測

菌體量的測定：通過分光光度計(jì)測定發(fā)酵液在波長600nm下的吸光度值[17]；糖含量的測定：發(fā)酵液經(jīng)13000r/min離心2 min后，取上清液，經(jīng)適當(dāng)稀釋，采用SBA-40E生物傳感器進(jìn)行檢測；葡萄糖補(bǔ)加量測定：用電子天平記錄80%葡萄糖液的補(bǔ)加量；腺苷產(chǎn)量的測定：采用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中腺苷的含量[18-21]。葡萄糖消耗速率及糖苷轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下：

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值；采用Origin 2018軟件作圖；采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃嘌呤對枯草芽孢桿菌XGL產(chǎn)腺苷的影響

2.1.1 黃嘌呤的添加時(shí)機(jī)對枯草芽孢桿菌XGL產(chǎn)腺苷的影響

黃嘌呤添加時(shí)機(jī)對枯草芽孢桿菌XGL生物量及腺苷產(chǎn)量的影響見圖1。

圖1 黃嘌呤的添加時(shí)機(jī)對枯草芽孢桿菌XGL生物量（a）及腺苷產(chǎn)量（b）的影響Fig.1 Effect of xanthine addition time on biomass(a)and adenosine production(b)of Bacillus subtilis XGL

由圖1可知，在發(fā)酵前期，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有一定量的黃嘌呤，菌體長勢較快，腺苷產(chǎn)量較低。當(dāng)發(fā)酵16 h時(shí)，添加0.2 g/L黃嘌呤，與未添加黃嘌呤組相比，菌體生長速率加快，且腺苷產(chǎn)量升高。當(dāng)發(fā)酵32 h時(shí)，添加0.2 g/L黃嘌呤，與未添加黃嘌呤組相比，菌體開始大量生長，且腺苷產(chǎn)量增加；與發(fā)酵16 h時(shí)添加黃嘌呤組相比，菌體生長速度變快，但腺苷產(chǎn)量較低。結(jié)果表明，菌體出現(xiàn)長勢緩慢、腺苷產(chǎn)量較低的現(xiàn)象可能是由于黃嘌呤的缺乏導(dǎo)致的，因此，在發(fā)酵16 h時(shí)，向發(fā)酵液中及時(shí)添加0.2 g/L的黃嘌呤，以確保發(fā)酵液中黃嘌呤的量，從而促進(jìn)菌體的持續(xù)生長和腺苷的生產(chǎn)。

2.1.2 黃嘌呤添加方式對枯草芽孢桿菌XGL產(chǎn)腺苷的影響

黃嘌呤添加方式對枯草孢桿菌XGL生物量、葡萄糖消耗速率及腺苷產(chǎn)量的影響見圖2。

圖2 黃嘌呤添加方式對枯草芽孢桿菌XGL生物量（a）、葡萄糖消耗速率（b）及腺苷產(chǎn)量（c）的影響Fig.2 Effect of xanthine addition method on biomass(a),glucose consumption rate(b)and adenosine production(c)of Bacillus subtilis XGL

由圖2可知，在底料中直接加入0.2 g/L黃嘌呤后，在發(fā)酵前期，菌體OD600nm值快速上升，但發(fā)酵35 h后，OD600nm值基本保持不變；前期葡萄糖消耗速率較高，后期趨于平穩(wěn)；菌體在前期大量生產(chǎn)腺苷，且腺苷產(chǎn)量明顯高于其他幾種添加方式，但發(fā)酵后期腺苷產(chǎn)量趨于平穩(wěn)后下降，分析原因可能是黃嘌呤不足導(dǎo)致的。在發(fā)酵16 h一次性補(bǔ)加0.2 g/L黃嘌呤時(shí)，添加黃嘌呤之后，菌體快速生長，葡萄糖消耗速率加快，腺苷產(chǎn)量增加；發(fā)酵44～48 h時(shí)，菌體生長開始變緩，葡萄糖消耗速率及腺苷產(chǎn)量開始降低。在發(fā)酵16 h后分批次補(bǔ)加或流加黃嘌呤后，菌體快速持續(xù)的生長，葡萄糖消耗速率增大，同時(shí)腺苷產(chǎn)量持續(xù)升高，且流加黃嘌呤后，腺苷產(chǎn)量最高。發(fā)酵56 h時(shí)，四種添加方式下腺苷的最終產(chǎn)量分別為18.0 g/L、19.0 g/L、30.2 g/L、34.4 g/L，結(jié)果表明，持續(xù)流加黃嘌呤的方式對于腺苷的發(fā)酵生產(chǎn)效果最好。

2.2 谷氨酰胺對枯草芽孢桿菌XGL產(chǎn)腺苷的影響

2.2.1 底物中谷氨酰胺不同添加量對枯草芽孢桿菌XGL產(chǎn)腺苷的影響

底物中谷氨酰胺添加量對枯草芽孢桿菌XGL菌體量、葡萄糖消耗速率、腺苷產(chǎn)量及糖苷轉(zhuǎn)化率的影響見圖3。

由圖3a可知，在發(fā)酵初期，不同的谷氨酰胺添加量下菌體量無明顯差異；在發(fā)酵中后期，隨著谷氨酰胺添加量的增加生物量呈先增加后減少的趨勢，且當(dāng)谷氨酰胺添加量為6 g/L時(shí)，生物量最大，發(fā)酵56 h時(shí)，生物量達(dá)84.6。

由圖3b可知，不添加谷氨酰胺時(shí)葡萄糖消耗速率最低，隨著谷氨酰胺添加量的增加葡萄糖消耗速率呈先增加后減少的趨勢，且當(dāng)谷氨酰胺添加量為6 g/L時(shí)，葡萄糖消耗速率最大，發(fā)酵28 h時(shí)，葡萄糖消耗速率達(dá)5.65 g/（L/h）。說明底物中谷氨酰胺的添加有助于發(fā)酵中后期菌體的生長和葡萄糖消耗速率的增加。

由圖3c可知，隨著底物中谷氨酰胺添加量的增加腺苷產(chǎn)量呈先增加后平穩(wěn)的趨勢，當(dāng)谷氨酰胺添加量為6 g/L時(shí)，腺苷產(chǎn)量最高，發(fā)酵56 h時(shí)，腺苷產(chǎn)量達(dá)42.5 g/L，說明添加谷氨酰胺可以提高腺苷產(chǎn)量。由此可見，谷氨酰胺的最適添加量為6 g/L。

由圖3d可知，在不添加谷氨酰胺時(shí)，糖苷轉(zhuǎn)化率為13.2%，在添加了谷氨酰胺后糖苷轉(zhuǎn)化率有所提升。當(dāng)谷氨酰胺添加量為6 g/L時(shí)，糖苷轉(zhuǎn)化率達(dá)到了16%。

圖3 底物中谷氨酰胺添加量對枯草芽孢桿菌XGL生物量（a）、葡萄糖消耗速率（b）、腺苷產(chǎn)量（c）及糖苷轉(zhuǎn)化率（d）的影響Fig.3 Effect of glutamine addition in substrate on biomass(a),glucose consumption rate(b),adenosine production(c)and glycoside conversion rate(d)of Bacillus subtilis XGL

2.2.2 發(fā)酵過程中谷氨酰胺流加量對枯草芽孢桿菌XGL產(chǎn)腺苷的影響

為探究在整個(gè)發(fā)酵過程中是否保持一定濃度的谷氨酰胺有利于菌體產(chǎn)腺苷，在發(fā)酵中期后（32 h）向發(fā)酵罐中流加不同質(zhì)量濃度的谷氨酰胺，考察流加不同質(zhì)量濃度的谷氨酰胺對枯草芽孢桿菌XGL菌體量、葡萄糖消耗速率、腺苷產(chǎn)量及糖苷轉(zhuǎn)化率見圖4。

由圖4可知，隨著谷氨酰胺流加質(zhì)量濃度的增加，生物量及葡萄糖消耗速率會有小幅的增加，腺苷產(chǎn)量也在增加，但當(dāng)谷氨酰胺的流加質(zhì)量濃度達(dá)到6 g/L時(shí)，生物量、葡萄糖消耗速率及腺苷產(chǎn)量均達(dá)到峰值。當(dāng)發(fā)酵56 h時(shí)，生物量及腺苷產(chǎn)量分別為86.8、45.8 g/L，相比于底物中直接添加6 g/L的谷氨酰胺腺苷產(chǎn)量（42.5 g/L）提高7.8%；相比于不添加谷氨酰胺時(shí)，腺苷產(chǎn)量（34.4 g/L）提高33%。

圖4 流加不同質(zhì)量濃度的谷氨酰胺對枯草芽孢桿菌XGL生物量（a）、葡萄糖消耗速率（b）、腺苷產(chǎn)量（c）及糖苷轉(zhuǎn)化率（d）的影響Fig.4 Effect of different concentrations of glutamine on biomass(a),adenosine production(b),adenosine production(c)and glycoside conversion rate(d)of Bacillus subtilis XGL

由圖4亦可知，糖苷轉(zhuǎn)化率隨著谷氨酰胺流加質(zhì)量濃度的增加先升高，當(dāng)流加的谷氨酰胺的質(zhì)量濃度達(dá)到6 g/L時(shí)，糖苷轉(zhuǎn)化率達(dá)到了16.3%。相比于底物中直接添加6 g/L谷氨酰胺增加了0.3%。

綜上所述，在發(fā)酵32 h后可以流加6 g/L的谷氨酰胺提高腺苷產(chǎn)量。分析原因可能是谷氨酰胺是腺苷合成的前體，且在發(fā)酵中后期隨著氨水的流加，發(fā)酵液中銨根離子增多，菌體代謝受到影響，谷氨酰胺合成酶的活力下降，進(jìn)而影響腺苷的合成。

3 結(jié)論

在含有100 mg/L黃嘌呤的發(fā)酵培養(yǎng)基中，當(dāng)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）XGL發(fā)酵16 h后，持續(xù)向發(fā)酵液中流加3 g/L的黃嘌呤溶液200 mL可以使腺苷產(chǎn)量達(dá)到34.4 g/L，相比于不補(bǔ)充黃嘌呤時(shí)腺苷產(chǎn)量（11.2 g/L）提高207%。在此基礎(chǔ)上，再向底物中添加6 g/L谷氨酰胺，在發(fā)酵32 h后持續(xù)向發(fā)酵液中流加6 g/L的谷氨酰胺，腺苷產(chǎn)量達(dá)到45.8 g/L，相比于不添加谷氨酰胺腺苷產(chǎn)量（34.4 g/L）提高33%。因此，在B.subtilisXGL發(fā)酵過程中，可以通過流加一定量的黃嘌呤和谷氨酰胺的方法提高腺苷產(chǎn)量。