曾 靜，袁 林*，郭建軍，魏國汶

（江西省科學院 微生物研究所，江西 南昌 330096）

淀粉廣泛存在于谷物類飼料中，是大多數(shù)畜禽所需能量的主要來源之一[1]。淀粉酶是催化淀粉水解成葡萄糖、麥芽糖及糊精一類酶的總稱[2]。在動物生產(chǎn)行業(yè)中，淀粉酶主要作為飼料添加劑被添加到動物飼料中，以彌補動物體內(nèi)淀粉酶的不足，從而提高飼料利用率，降低養(yǎng)殖成本，減少養(yǎng)殖環(huán)境的污染[3-4]。但是淀粉酶作為蛋白質(zhì)類生物大分子，易受飼料加工制粒、貯藏等因素影響而失活[3-4]。

乳酸菌是一群革蘭氏陽性、能夠發(fā)酵碳水化合物、以乳酸為主要代謝產(chǎn)物的各類細菌統(tǒng)稱，是人與大多數(shù)動物腸道內(nèi)的常見優(yōu)勢菌群，被公認為安全級微生物[5-8]。乳酸菌是使用得最廣泛的一類益生菌。此外，雖然與其他原核表達系統(tǒng)（如大腸桿菌（Escherichia coli）表達系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）表達系統(tǒng)等）相比，乳酸菌表達系統(tǒng)的研究和開發(fā)較晚，但是隨著人們對乳酸菌各類表達調(diào)控元件的不斷研究，陸續(xù)研發(fā)出了適用于乳酸菌的多種載體，如克隆載體、表達載體（分泌型表達載體、組成型表達載體）、整合載體等，使得乳酸菌工程菌的構(gòu)建成為了目前研究的熱點[9-13]。乳酸菌表達系統(tǒng)的優(yōu)點在于乳酸菌安全、無內(nèi)毒素，表達的外源蛋白無需經(jīng)過純化可以直接連同菌體一起使用。外源蛋白質(zhì)在乳酸菌表達系統(tǒng)中的分泌表達依賴于信號肽的引導[14]。已有研究表明，乳酸菌表達系統(tǒng)中不同信號肽對同一種外源蛋白質(zhì)的引導分泌效率可能相差較大，即信號肽與外源蛋白質(zhì)之間存在適配性[15]。因此，針對特定的外源蛋白質(zhì)需要選擇合適的信號肽來實現(xiàn)其在乳酸菌表達系統(tǒng)中的有效分泌表達。

來源于高溫烷烴地芽孢桿菌（Geobacillus thermoleovorans）的α-淀粉酶Gt-amy屬于嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶，可有效降解玉米淀粉，其最適反應pH值為5.0，Gt-amy是目前文獻報道的玉米淀粉降解率最高的嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶[16]。為了提高嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy在飼料工業(yè)中的應用可行性，該研究以實驗室前期從健康仔豬腸道黏膜上分離純化得到的具有優(yōu)良益生特性的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）EXW27[17]為宿主菌，以大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒pSIP401為表達載體，對來源于糞腸球菌的8種信號肽進行篩選，旨在獲得引導Gt-amy在糞腸球菌EXW27中高效分泌表達的信號肽，從而構(gòu)建組成型分泌表達生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的重組糞腸球菌，以期構(gòu)建既具有益生特性又具有生淀粉α-淀粉酶活性的轉(zhuǎn)基因糞腸球菌，為生淀粉α-淀粉酶Gt-amy在飼料工業(yè)的應用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、糞腸球菌（Entercoccus faecalis）EXW27、重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamyhds[18]、大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒pSIP401[19]：實驗室保存。

1.1.2 試劑

KOD-Plus-neo脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：日本Toyobo公司；DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker：美國Fermentase公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒：美國Omega Bio-tek公司；Chelating SepharoseTMFast Flow：美國GE Healthcare公司；Bradford法蛋白濃度測定試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物、紅霉素（均為分析純）：上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，瓊脂2%。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

MRS液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，牛肉膏1%，葡萄糖2%，磷酸氫二鉀0.2%，檸檬酸氫二銨0.2%，乙酸鈉0.4%，硫酸鎂0.058%，硫酸錳0.025%，吐溫0.1%，pH 6.2。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。MRS固體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂。

1.2 儀器與設備

MastercyclergradientPCR儀：美國Eppendorf公司；TY04S-3C型凝膠成像系統(tǒng)：北京君意東方電泳設備有限公司；SCIENTZ-ⅡD型超聲波細胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；SP-752PC型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒pSIP401Z-gtamyhds的構(gòu)建與鑒定

基于生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的基因gtamy的堿基序列，設計引物P1和P2（見表1）。以重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamyhds為模板，PCR擴增基因gtamy中不含信號肽的結(jié)構(gòu)基因gtamyhds。PCR擴增體系：10×buffer I 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）5 μL，MgSO45 μL，引物P1和P2各2 μL，模板1 μL，KOD-Plus-neo DNA聚合酶2 μL，雙蒸水（ddH2O）28 μL。PCR擴增條件：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，74 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；74 ℃再延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)Xho I和Hind III雙酶切，連接至經(jīng)相同雙酶切處理的載體pSIP401，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSIP401-gtamyhds。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細胞，并涂布于含200 μg/mL紅霉素的LB固體平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取LB固體平板上的轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒，采用Xho I和Hind III進行雙酶切，鑒定陽性重組子。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒所用引物序列Table 1 Primer sequences for the construction of recombinant plasmids

在重組質(zhì)粒pSIP401-gtamyhds的基礎上，參照文獻[20]中人工啟動子文庫構(gòu)建方法，根據(jù)質(zhì)粒pSIP401和基因gtamy的堿基序列設計引物P3和P4，將重組質(zhì)粒pSIP401-gtamyhds中啟動子替換為本實驗室前期研究工作篩選得到的糞腸球菌中組成型高表達的啟動子p10[21]，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSIP401Zgtamyhds。組成型高表達啟動子p10的堿基序列為5'-AGATCTGCATAAAAAGTTCTTGACACTATATTAAGGCATTGTTAAGATATAGAAATAGCG-3'。具體步驟如下：以重組質(zhì)粒pSIP401-gtamyhds為模板，采用引物P3和P4進行PCR擴增。PCR擴增體系：10×buffer I 5 μL，dNTP 5 μL，MgSO45 μL，引物P3和P4各2 μL，模板1 μL，KOD-Plus-neo DNA聚合酶2 μL，ddH2O 28 μL。PCR擴增條件：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，74 ℃延伸10 s，30個循環(huán)；74 ℃再延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)Bgl II和Nco I雙酶切，連接至經(jīng)相同雙酶切處理的載體pSIP401-gtamyhds，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSIP401Z-gtamyhds。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細胞，并涂布于含200 μg/mL紅霉素的LB固體平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取LB固體平板上轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，并與對應基因序列進行BLAST比對確認。

1.3.2 信號肽篩選質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)文獻[22]提供的糞腸球菌來源的信號肽（s1～s8）的基因序號，在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中找出糞腸球菌中信號肽的氨基酸序列和對應的基因序列，其中氨基酸序列的具體信息見表2。采用化學全合成方法[18]合成包含限制性酶切位點Nco I和Xho I以及信號肽堿基序列的DNA片段：5'-AGCCATGG（Nco I）-信號肽堿基序列-CTCGAG（Xho I）TG-3'。所合成的DNA片段經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切，連接至經(jīng)相同雙酶切處理的載體pSIP401Z-gtamyhds，構(gòu)建信號肽篩選質(zhì)粒pSIP401Z-（s1～s8）-gtamyhds。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細胞，并涂布于含200 μg/mL紅霉素的LB固體平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取LB固體平板上轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，并與對應基因序列進行BLAST比對確認。

表2 糞腸球菌來源的信號肽Table 2 Signal peptides from Entercoccus faecalis

1.3.3 重組糞腸球菌的構(gòu)建

參照文獻[19]將信號肽篩選質(zhì)粒pSIP401Z-（s1～s8）-gtamyhds電擊轉(zhuǎn)化至E.faecalisEXW27，并涂布于含10μg/mL紅霉素的MRS固體平板上，37℃培養(yǎng)24h，獲得重組E.faecalisEXW27/pSIP401Z-（s1～s8）-gtamyhds（S1～S8）。

1.3.4 重組糞腸球菌中嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的組成型分泌表達和純化

將重組糞腸球菌涂布于含10 μg/mL紅霉素的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。然后轉(zhuǎn)接于含10 μg/mL紅霉素的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，接種量為3%（V/V），37 ℃條件下靜置培養(yǎng)36 h。發(fā)酵液在4 ℃條件下經(jīng)8 000×g離心5 min，分別收集菌體沉淀和發(fā)酵上清液。采用50 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）（pH 5.0）緩沖液重懸菌體沉淀，置于冰上用超聲波破碎細胞。超聲波細胞破碎條件：超聲波功率250 W，超聲波破碎時間3 s，間歇6 s。超聲波處理菌體細胞至菌體懸液變?yōu)榫坏娜芤海?2 000×g離心5 min后收集上清，即為重組糞腸球菌胞內(nèi)成分。分別測定發(fā)酵上清液和重組糞腸球菌胞內(nèi)的α-淀粉酶酶活，并采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測發(fā)酵上清液和重組糞腸球菌胞內(nèi)重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶的表達情況。以轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒pSIP401的重組糞腸球菌為陰性對照（C1），以轉(zhuǎn)化了重組載體pSIP401Z-gtamyhds的重組糞腸球菌為陰性對照（C2），篩選最優(yōu)信號肽。

采用Ni2+親和層析柱對發(fā)酵上清液中的嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy進行純化，用250 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫，即得到純化后的嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy。利用SDS-PAGE檢測嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的純度，并采用Bradford法[23]測定其濃度。

1.3.5 重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的酶學性質(zhì)分析

參照文獻[24]測定重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的最適反應pH值、pH穩(wěn)定性、最適反應溫度、80 ℃熱穩(wěn)定性以及玉米淀粉降解率。

1.3.6 檢測方法

嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy分子質(zhì)量：參照文獻[25]，采用SDS-PAGE檢測。

嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy對可溶性淀粉的酶活力測定：將10μL酶液與490μL含1%可溶性淀粉的50 mmol/L MES（pH 5.0）緩沖液混合，80 ℃條件下反應30 min，迅速冰浴，終止反應，然后采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitros alicylic acid，DNS）法[26]測定反應體系中還原糖量。酶活力單位定義：在一定反應條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

運用軟件SigmaPlot 12.5對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并作圖，結(jié)果均以“平均值±標準偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 信號肽的篩選

重組E.faecalisEXW27/pSIP401Z-（s1～s8）-gtamyhds（S1～S8）發(fā)酵上清液和胞內(nèi)嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy活性測定結(jié)果見圖1。

圖1 不同信號肽對嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy活性的影響Fig.1 Effect of different signal peptides on thermoacidiphilic raw starch α-amylase Gt-amy activity

由圖1可知，陰性對照C1和C2發(fā)酵上清液中的Gt-amy活性較低，胞內(nèi)Gt-amy活性較高，8種信號肽均能引導Gt-amy分泌至發(fā)酵上清液中，其中重組菌S7發(fā)酵上清液中的Gt-amy活力最高，為310 U/mL。結(jié)果表明，信號肽s7有利于嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy分泌至胞外，可實現(xiàn)Gt-amy在糞腸球菌中的高效分泌表達。

重組E.faecalisEXW27/pSIP401Z-（s1～s8）-gtamyhds（S1～S8）發(fā)酵上清液和細胞裂解液的SDS-PAGE檢測結(jié)果見圖2。由圖2可知，轉(zhuǎn)化了不同信號肽篩選載體的重組糞腸球菌的發(fā)酵上清液中均有一條分子質(zhì)量約為56 kDa的蛋白質(zhì)條帶，而陰性對照C1和C2的發(fā)酵上清液中未見明顯的蛋白質(zhì)條帶。且使用信號肽s7后，重組糞腸球菌發(fā)酵上清液中嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的表達量明顯提高，這與α-淀粉酶活性測定結(jié)果一致。由圖2B可知，陰性對照C2的發(fā)酵菌體中能觀察到約56 kDa的蛋白質(zhì)條帶，而陰性對照C1以及其他重組糞腸球菌的發(fā)酵菌體中未能明顯觀察到大小相同的蛋白質(zhì)條帶。

圖2 重組糞腸球菌上清液（A）及細胞裂解液（B）的SDS-PAGE結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE results of fermentation supernatant(A)and cell lysis solution(B)of recombinant Entercoccus faecalis

以上研究結(jié)果表明，信號肽s7能夠引導嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy在糞腸球菌EXW27中分泌表達，據(jù)文獻報道，信號肽s7為脂蛋白（EF0071）的信號肽[22]。

2.2 重組糞腸球菌中嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的純化

重組糞腸球菌S7中嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy純化后的SDS-PAGE檢測結(jié)果見圖3。由圖3可知，重組糞腸球菌S7中嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的分子質(zhì)量約為56 kDa，與理論值基本一致。

圖3 純化后嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE results of thermoacidiphilic raw starch α-amylase Gt-amy after purification

2.3 重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的酶學性質(zhì)

2.3.1 重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的最適作用pH值和pH穩(wěn)定性

pH值對重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy活力的影響見圖4。由圖4A可知，重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的最適反應pH值為5.0，且其在pH值4.5～7.0范圍內(nèi)具有50%以上相對酶活。由圖4B可知，其在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)具有50%以上的相對酶活。重組糞腸球菌表達的重組Gt-amy的最適反應pH值和pH穩(wěn)定性與野生型Gt-amy[16]基本一致。

圖4 重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的最適作用pH值（A）及pH穩(wěn)定性（B）Fig.4 Optimal reaction pH(A)and pH stability(B)of recombination thermoacidiphilic raw starch α-amylase Gt-amy

2.3.2 重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的最適作用溫度和熱穩(wěn)定性

溫度對重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy活力的影響見圖5。由圖5A可知，重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的最適反應溫度為80 ℃。由圖5B可知，其于80 ℃的半衰期約為3 h。重組糞腸球菌表達的重組Gt-amy的最適反應溫度和于80 ℃條件下的熱穩(wěn)定性與野生型Gt-amy[16]基本一致。

圖5 重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的最適作用溫度（A）及80 ℃條件下熱穩(wěn)定性（B）Fig.5 Optimal reaction temperature(A)and thermal stability(B)at 80 ℃of recombination thermoacidiphilic raw starch α-amylase Gt-amy

2.3.3 嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy對玉米淀粉的降解

圖6 重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的玉米淀粉降解率Fig.6 Corn starch hydrolysis rate of recombinant thermoacidiphilic raw starch α-amylase Gt-amy

由圖6可知，在40 ℃條件下，重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy對30%玉米淀粉的降解率隨著時間的延長而提高。當反應時間達到3 h，重組嗜熱酸性生淀粉Gt-amy對玉米淀粉的降解率達到55.8%。結(jié)果表明，重組糞腸球菌所表達的重組嗜熱酸性生淀粉Gt-amy可降解玉米淀粉，這為重組嗜熱酸性生淀粉Gt-amy在飼料工業(yè)中的提供了理論依據(jù)。

3 結(jié)論

以誘導型大腸桿菌-乳酸菌穿梭載體pSIP401為表達載體，首先采用本實驗室前期研究工作篩選得到的高效組成型啟動子P10替換pSIP401-gtamyhds中誘導型啟動子，然后分別引入糞腸球菌來源的8種信號肽，構(gòu)建嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy在糞腸球菌EXW27中組成型分泌表達的信號肽篩選載體。采用電擊轉(zhuǎn)化方法將信號肽篩選載體轉(zhuǎn)入具有優(yōu)良益生特性的糞腸球菌EXW27來構(gòu)建重組糞腸球菌。通過比較重組糞腸球菌的發(fā)酵上清液中α-淀粉酶活性，確定信號肽s7能夠最高效引導重組Gt-amy分泌至重組糞腸球菌胞外，發(fā)酵上清液中重組Gt-amy活性達到310 U/mL。重組Gt-amy的最適反應pH值為5.0，在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，最適反應溫度為80 ℃，于80 ℃的半衰期為3 h，在40 ℃條件下反應3 h，對玉米淀粉的降解率達到55.8%。本研究構(gòu)建了既具有益生特性又具有嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶活性的轉(zhuǎn)基因糞腸球菌，這為嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy在飼料工業(yè)的應用提供了新思路，也為研制新型轉(zhuǎn)基因微生態(tài)制劑奠定了基礎。