陳翠翠，袁 野，杭 鋒，張 灝，，李元昆，陸文偉，

（1.江南大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學（揚州）食品生物技術(shù)研究所，江蘇 揚州 225004；4.新加坡國立大學 楊璐齡醫(yī)學院微生物學系，新加坡）

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是人體和動物腸道內(nèi)的重要菌群，對宿主具有積極的健康益處[1-2]，如促進人體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[3]，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，治療腹瀉，降低膽固醇[4-5]等，因此近年來被廣泛應用在功能性食品中。菌粉產(chǎn)品相比于液態(tài)益生菌產(chǎn)品，具有便于運輸、耐儲藏和活菌數(shù)高的優(yōu)點，從工業(yè)角度更有利于開發(fā)益生菌制劑產(chǎn)品。

生物膜是細菌自身與其分泌的多糖、蛋白、脂類化合物和核酸等胞外聚合物基質(zhì)進行有序地包裹，并形成具有一定結(jié)構(gòu)的微生物群落[6]。研究發(fā)現(xiàn)自然界中的99%細菌基本上都是以生物膜的形式存在的[7]。生物膜細菌在不利環(huán)境條件下，會通過自身分泌的胞外多糖聚合在固體表面，阻止了細菌與有害物質(zhì)的直接接觸，提高對惡劣環(huán)境的耐受性[8]。近年來，對生物膜的研究主要集中在污水處理和醫(yī)學領(lǐng)域，研究方向主要為抑制病原菌生物膜[9]的產(chǎn)生，特別是如何消除銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的生物膜[10-11]。同樣的，益生菌也可以通過生成生物膜增強自身對外界不利環(huán)境的抵御能力。GROSSOVA M等[12]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌生物膜比病原微生物生物膜對低pH值和膽鹽具有更高的抗性，CHEOW W S 等[13]驗證形成生物膜后的鼠李糖乳桿菌微膠囊，冷凍干燥能力提高了將近40倍。

生物膜的形成在很大程度上受到環(huán)境的影響，且生物膜的結(jié)構(gòu)很大程度上取決于環(huán)境，環(huán)境會影響細胞的基因表達，第二信使環(huán)磷酸腺苷（cyclicadenosinemonophosphate，cAMP）和環(huán)二鳥苷酸（bis-（3'-5'）-cyclic diguanosine monophosphate，c-di-GMP）是控制生物膜形成的主要調(diào)控因子，調(diào)控生物膜表面蛋白、胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）的合成[14]。LIU J等[15]通過控制碳源（甘油）和氮源（谷氨酸）研究枯草芽孢桿菌生物膜中菌群面對營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時的反應，發(fā)現(xiàn)是谷氨酸饑餓（而不是甘油）引起了生物膜生長速率振蕩，說明碳源和氮源對生物膜的影響不同。生物膜細菌多發(fā)生在潮濕環(huán)境下，以固相基質(zhì)為載體形成微生物群落。生物膜的產(chǎn)生離不開成膜基質(zhì)，目前研究人員常用的成膜載體主要為微孔板[16]，在實際工業(yè)生產(chǎn)中的指導意義較小。USHAKOVA N A等[17]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌在麥麩基質(zhì)上成膜后具有更高的生物活性。OLSON J K等[18]研究發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌在生物相容微球上生成生物膜后，可通過宿主的胃腸道（包括低pH值、宿主免疫系統(tǒng)的效應因子以及與共生菌的競爭）保持更高的存活力。本試驗通過建立基于非水溶性膳食纖維的成膜體系，探究培養(yǎng)基碳源、氮源，培養(yǎng)溫度、初始pH值和NaCl添加量對雙歧桿菌基于非水溶性膳食纖維的生物膜成膜的影響，通過單因素試驗和響應曲面分析試驗對基于非水溶性膳食纖維的雙歧桿菌成膜條件進行了優(yōu)化，為進一步提高雙歧桿菌的生物膜量，實現(xiàn)工業(yè)化應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

雙歧桿菌（Bifidobacterium）JSWX26-7：江南大學食品生物技術(shù)中心菌種保藏庫。

1.1.2 化學試劑

低聚半乳糖、低聚果糖、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、魚粉蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、無水乙酸鈉、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、檸檬酸氫二銨、吐溫-80、氯化鈉、半胱氨酸鹽酸鹽、三水合磷酸氫二鉀：國藥集團化學試劑有限公司；酵母粉：英國Oxoid公司；黃豆粉：市售。試驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：牛肉膏10.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，無水葡萄糖20.0 g/L，無水乙酸鈉2.0 g/L，三水合磷酸氫二鉀2.6 g/L，七水合硫酸鎂0.5 g/L，一水硫酸錳0.25 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，吐溫-80 1.0 mL/L，調(diào)整pH=6.8，于115 ℃滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基加入2.0%瓊脂。115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ME3002E臺式電子天平、FE-20 pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LAB DANCER 漩渦振蕩器：德國IKA公司；GR60DA 立式自動壓力滅菌鍋：南京庚辰儀器有限公司；DG250 厭氧工作站：英國Don Whitley Scientific公司；KQ-700E 超聲破碎機：昆山市超聲儀器有限公司；TG16AWS 臺式高速離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化和動態(tài)生物膜培養(yǎng)

取保藏于-80 ℃甘油管中的雙歧桿菌，用接種環(huán)在MRS平板上進行三區(qū)劃線，37℃厭氧培養(yǎng)48h，挑取單菌落于5mL的MRS液體培養(yǎng)基[19]，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，再按2%（V/V）接種量接種于5 mL液體MRS培養(yǎng)基中，活化3代后備用。

取活化三代后的雙歧桿菌1 mL于裝有50 mL MRS液體培養(yǎng)基（黃豆粉添加量10 g/L）的錐形瓶中，并將其固定于樂扣盒中，放入?yún)捬醮?，密封。將樂扣盒固定于搖床上，設(shè)定轉(zhuǎn)速為100 r/min，使大豆纖維懸浮在培養(yǎng)基中而不沉降，讓菌體充分黏附于基質(zhì)上形成生物膜。使培養(yǎng)基在搖動狀態(tài)下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 平板計數(shù)法測定成膜活菌數(shù)[17-20]

取出培養(yǎng)液充分振蕩混合均勻，吸取菌液1 mL于2 mL EP管中，同一試驗組需要做兩份，一份于離心機中以100 r/min離心3 min（經(jīng)預實驗證明此轉(zhuǎn)速離心時菌體未離心下來，以黃豆粉為載體基質(zhì)的成膜菌可離心下來）取上清液進行平板菌落計數(shù)，計數(shù)結(jié)果為游離活菌數(shù)；另外一份于超聲清洗機中，以700 W的功率超聲處理20 min[21]，計數(shù)結(jié)果為總活菌數(shù)。

成膜活菌數(shù)=總活菌數(shù)-游離活菌數(shù)

1.3.3 雙歧桿菌成膜條件優(yōu)化單因素試驗

通過改變培養(yǎng)基中使用的碳源（葡萄糖、低聚半乳糖、低聚果糖）、氮源（胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、魚粉蛋白胨），培養(yǎng)溫度（31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃）、初始pH值（5.8、6.3、6.8、7.3、7.8）、培養(yǎng)基中NaCl添加量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%），探究不同培養(yǎng)基碳源、氮源，培養(yǎng)溫度、初始pH值和NaCl添加量對雙歧桿菌基于非水溶性膳食纖維的生物膜成膜的影響。

1.3.4 雙歧桿菌成膜條件優(yōu)化響應面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取對雙歧桿菌成膜活菌數(shù)（Y）影響顯著的3個因素初始pH值（X1），培養(yǎng)溫度（X2）和NaCl添加量（X3），根據(jù)Box-Behnken試驗[22]設(shè)計原理，利用Design-Expert軟件進行3因素3水平響應面優(yōu)化[23]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)為重復3次所得，以平均值±標準偏差表示。采用MicrosoftExcel2016進行數(shù)據(jù)處理，運用方差分析（analysis of variance，ANOVA）進行統(tǒng)計學分析，兩組數(shù)據(jù)的差異分析采用T檢驗進行判斷，P＜0.05則認為差異顯著。采用Design-ExpertV8.0.6進行響應面分析和作圖。采用Graphpad Prism 7.0進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌成膜條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 不同碳源對生物膜成膜情況的影響

由圖1可知，葡萄糖為碳源時成膜活菌數(shù)達到最大，為9.30×108CFU/mL。而以低聚半乳糖、低聚果糖為碳源時生物膜活菌數(shù)普遍較低。SLIZOVA M等[24]研究結(jié)果顯示，不同碳源對生物膜的影響不同，葡萄糖存在下檢測到大量生物膜的形成，與本研究試驗結(jié)果基本一致。故選擇葡萄糖為最佳碳源。

圖1 培養(yǎng)基碳源對雙歧桿菌成膜的影響Fig.1 Effect of carbon source on biofilm formation of Bifidobacterium

2.1.2 不同氮源對生物膜成膜情況的影響

由圖2可知，當選用魚粉蛋白胨或胰蛋白胨為主要氮源時，成膜活菌數(shù)最大，為1.24×109CFU/mL，而以酪蛋白和大豆蛋白胨為主要氮源時，其成膜能力明顯下降，最低成膜活菌數(shù)僅為5.8×108CFU/mL。結(jié)果表明，不同氮源對生物膜的成膜影響不同。為實現(xiàn)工業(yè)化應用，有效減低成本，故選擇胰蛋白胨為最佳氮源。

圖2 培養(yǎng)基氮源對雙歧桿菌成膜的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on biofilm formation of Bifidobacterium

2.1.3 不同培養(yǎng)溫度對生物膜成膜情況的影響

由圖3可知，隨著培養(yǎng)溫度的提高，成膜活菌數(shù)呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。培養(yǎng)溫度為37 ℃時，成膜活菌數(shù)最高，為9.46×108CFU/mL，當溫度低于或高于37 ℃時，不利于雙歧桿菌的生長，細菌密度較低，無法達到生物膜初期黏附，造成生物膜形成能力的下降，其成膜活菌數(shù)普遍低于最適生長溫度。故選擇培養(yǎng)溫度為37 ℃。

圖3 培養(yǎng)溫度對雙歧桿菌成膜的影響Fig.3 Effect of culture temperature on biofilm formation of Bifidobacterium

2.1.4 初始pH值對生物膜成膜情況的影響

由圖4可知，隨著培養(yǎng)基初始pH值的增加，游離菌數(shù)、成膜菌數(shù)和總菌數(shù)均呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。培養(yǎng)前初始pH=6.8時，成膜菌、總菌均最多，分別為1.15×109CFU/mL和1.49×109CFU/mL。在一定范圍內(nèi)，當?shù)陀诨蚋哂谧钸mpH值范圍時，并不利于雙歧桿菌的生長，導致其成膜菌數(shù)和總菌數(shù)的下降。當初始pH值過高時（pH=7.8），游離菌、成膜菌、總菌均最少，雙歧桿菌基本不能生長。故選擇初始pH值為6.8。

圖4 初始pH值對雙歧桿菌成膜的影響Fig.4 Effect of initial pH on biofilm formation of Bifidobacterium

2.1.5 不同NaCl添加量對生物膜成膜情況的影響

由圖5可知，當NaCl添加量為0～0.5%時，雙歧桿菌成膜菌數(shù)不斷升高；當NaCl的添加量為0.5%時，雙歧桿菌成膜菌數(shù)達到最高，為1.06×109CFU/mL；當NaCl添加量＞0.5%時，游離菌數(shù)、成膜菌數(shù)和總菌數(shù)均呈現(xiàn)下降的趨勢。YAN J等[25]研究發(fā)現(xiàn)滲透壓力驅(qū)動下能夠促進霍亂弧菌對周圍營養(yǎng)物質(zhì)的利用，有利于生物膜的形成。故選擇NaCl添加量為0.5%。

圖5 NaCl添加量對雙歧桿菌成膜情況的影響Fig.5 Effect of NaCl addition on biofilm formation of Bifidobacterium

2.2 雙歧桿菌成膜條件優(yōu)化響應面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以成膜活菌數(shù)（Y）為響應值，以初始pH值（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）和NaCl添加量（X3）為考察因素進行響應面優(yōu)化試驗，Box-Behnken試驗結(jié)果與分析見表1，方差分析見表2。

表1 雙歧桿菌成膜條件優(yōu)化Box-Behnken試驗結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of Box-Behnken experiments for biofilm formation condition optimization of Bifidobacterium

表2 響應面回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of response surface quadratic model

運用Design Expert V8.0.6軟件對表1結(jié)果進行擬合，得回歸方程：

由表2可知，所建立模型的P＜0.000 1，極顯著；失擬項P＞0.05，不顯著，表明該回歸模型具有較高可靠性；另外，模型的決定系數(shù)R2為0.996，說明擬合程度很好，校正決定系數(shù)R2Adj為0.992，指出預測值與實際值具有高度的相關(guān)性。經(jīng)回歸模型方差分析，一次項X3和二次項X12、X22、X32對基于非水溶性膳食纖維的雙歧桿菌成膜活菌數(shù)影響達到極顯著水平（P＜0.01），而一次項X1、X2、交互項X1X2、X1X3、X2X3均無顯著影響（P＞0.05）。經(jīng)Design Expert V8.0.6軟件對回歸模型進行優(yōu)化分析得到最佳條件：初始pH值為7.11，培養(yǎng)溫度為37.01℃，NaCl添加量為0.35%。在此優(yōu)化成膜條件下，預測得到的生物膜活菌數(shù)最大理論值為1.28×109CFU/mL。根據(jù)回歸方程，得到各因素交互作用對雙歧桿菌成膜影響的響應面及等高線，結(jié)果見圖6。

圖6 初始pH值、培養(yǎng)溫度和NaCl添加量交互作用對雙歧桿菌成膜影響的響應面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial pH,culture temperature and NaCl addition on biofilm formation of Bifidobacterium

由圖6可知，隨著3個因素水平的逐漸升高，雙歧桿菌成膜活菌數(shù)呈現(xiàn)先增后降的趨勢，交互作用的3個響應面均出現(xiàn)極大值。等高線圖顯示X1X2（初始pH值、培養(yǎng)溫度）、X2X3（培養(yǎng)溫度、NaCl添加量）、X1X3（初始pH值、NaCl添加量）的交互作用相對較弱，這與響應面二次模型方差分析結(jié)果一致。

2.2.2 驗證試驗

根據(jù)以上得出的最優(yōu)發(fā)酵條件初始pH值為7.11，培養(yǎng)溫度為37.01 ℃，NaCl添加量為0.35%。根據(jù)實際操作條件調(diào)整為初始pH值7.0、培養(yǎng)溫度為37℃、NaCl添加量為0.35%，此條件下培養(yǎng)雙歧桿菌，進行3次平行的驗證試驗，得到基于非水溶性膳食纖維的雙歧桿菌成膜活菌數(shù)平均實際值為1.22×109CFU/mL，所得結(jié)果與預測值基本一致，驗證了模型的可靠性。

3 結(jié)論

本試驗通過單因素試驗、Box-Behnken響應面分析試驗對雙歧桿菌動態(tài)成膜情況因素的影響進行了探究，結(jié)果表明基于非水溶性膳食纖維的雙歧桿菌動態(tài)成膜的最優(yōu)工藝參數(shù)：培養(yǎng)基碳源為葡萄糖、氮源為胰蛋白胨、額外添加0.35%NaCl，培養(yǎng)溫度37℃、初始pH值7.0。在此最優(yōu)成膜條件下，制備的雙歧桿菌成膜活菌數(shù)最多為1.22×109CFU/mL，為實現(xiàn)雙歧桿菌生物膜的可控成膜，特別是為工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵制備提供了理論基礎(chǔ)和試驗依據(jù)。