孫雪林 張亞同 陳頔 朱愿超 梁良 趙紫楠 胡欣

100730 北京醫(yī)院藥學(xué)部 國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院

心肌纖維化是以心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts， CFs)過(guò)度增殖、膠原異常沉積分布為特征的心臟間質(zhì)重構(gòu)[1]。心肌纖維化是多種心臟疾病的共同特征，可使心肌間質(zhì)沉積大量膠原，導(dǎo)致心室壁順應(yīng)性下降，引起心肌收縮力減弱，冠脈血流儲(chǔ)備降低。心肌纖維化長(zhǎng)期發(fā)展易導(dǎo)致心肌缺血復(fù)發(fā)、心力衰竭和猝死[2]。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD2(SET and MYND domain-containing protein 2)屬于SMYD家族成員，主要通過(guò)甲基化組蛋白和非組蛋白賴(lài)氨酸發(fā)揮基因調(diào)節(jié)作用[3-4]。近年研究證實(shí)SMYD家族在心臟中發(fā)揮了重要作用[5]。目前關(guān)于SMYD2在心肌纖維化中作用尚未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究SMYD2對(duì)CFs增殖和膠原合成的影響，探討SMYD2參與心肌纖維化發(fā)生的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 原代培養(yǎng)的Wistar乳鼠(≤3 d)原代CFs。購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。

1.1.2 構(gòu)建SMYD2-siRNA 大鼠SMYD2的siRNA應(yīng)用pGCsilencerTMU6/Neo/GFP/RNAi質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成)，針對(duì)SMYD2的序列，設(shè)計(jì)了3個(gè)干擾序列，如下：SMYD2-RNAi-1#，CCGTCTCTAGTGCCAACTTTA-CTCGAG-TAAAGTTGGCACTAGAGACGG；SMYD2-RNAi-2#，GCGGAGACAGATCAACTTGAA-CTCGAG-TTCAAGTTGATCTGTCTCCGC；SMYD2-RNAi-3#，CCTGTCAACACACAGGACTTT-CTCGAG-AAAGTCCTGTGTGTTGACAGG。pGCsi.U6/neo/GFP control-siRNA質(zhì)粒作為對(duì)照，對(duì)照序列如下：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAA-CGTGACACGTTCGGAGAA-3’。

1.1.3 試劑 改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)/High Glucose1×， DMEM/Low Glucose1(SH30021.01B-240-NWF0419， Hyclone公司)；胎牛血清(FBS)(SV30087.01B-2213-NUC0153， Hyclone， Thermo scientific公司)；胰酶細(xì)胞消化液(C0201， Beyotime公司)；EDTA.Na.2H2O(0105-100g， Amresco公司)；2.5% Trypsin 10×100 ml(15090-046， GIBCO， Invitrogen公司)；青霉素和鏈霉素溶液100× 100 ml(C0222， Beyotime公司)；溴脫氧尿苷(BrdU，Sigma公司)；血管緊張素Ⅱ(AngⅡ， Sigma公司)； 牛血清白蛋白(BSA) 5 g(Roche， 738238， 上海華舜生物工程有限公司)； 漢克平衡鹽溶液1×(HBSS)(14170， GIBCO， Invitrogen公司)；膠原酶COLLAGENASE type2 360 U/mg (4176， Worhtington Biochemical Corporation公司)；牛血清白蛋白Albumin bovine(735094-100g， Roche公司)；SMYD2(SAB2103606-100UL，SIGMA-ALDRICH公司)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)(sc-146， Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.1.4 PCR引物序列(表1)

表1 PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 CFs培養(yǎng) 取1～3 d齡的Wistar乳鼠，無(wú)菌條件下取出心臟，轉(zhuǎn)入預(yù)冷DMEM中，將心臟剪碎成大小一致的組織塊。移至50 ml無(wú)菌離心管中，加入10 ml消化液， 37℃在搖床消化10 min，重復(fù)上述步驟，37℃消化10 min，渦旋10 s，在上清液中加入等體積的DMEM 含血清培養(yǎng)基終止消化，4℃保存。將所收集的液體用200目的濾網(wǎng)過(guò)濾，2 500 r/min離心3 min，棄上清液，加入10%血清的DMEM培養(yǎng)液，吹打均勻后放入20 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中置于5% CO237℃孵箱中培育，2 h后心肌細(xì)胞貼壁，將含有CFs的上清轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 Western Blot 將所提取的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，用濕轉(zhuǎn)法將凝膠電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上。置于含5%封閉蛋白干粉的PBS溶液中，4℃封閉過(guò)夜。然后用PBS沖洗膜表面殘留蛋白封閉液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，分別加入克隆抗體(SMYD2、TGF-β1)室溫孵育NC膜12 h后，使用含0.05% Tween-20的PBS緩沖液沖洗NC膜。使用紅外熒光標(biāo)記抗體避光孵育NC膜1 h，以含0.05% Tween-20的PBS緩沖液沖洗NC膜，最后再用PBS沖洗，以降低背景。Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描分析。

1.2.3 qPCR 利用TRIZOL提取細(xì)胞RNA，加入20 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水，溶解RNA沉淀。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系和條件參照試劑說(shuō)明書(shū)，產(chǎn)物于-20℃保存。采用SYBR?Green PCR Master Mix試劑盒操作。SYBR Green Mix 10 μl，檢測(cè)上/下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，Nuclease-Free補(bǔ)足體積至20 μl。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參照。

1.2.4 MTT法 用胰蛋白酶將培養(yǎng)的CFs消化為單個(gè)懸浮細(xì)胞，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl培養(yǎng)液，含有細(xì)胞數(shù)大約為103～104，在CO2孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞。加入AngⅡ和SMYD2-siRNA處理后，培養(yǎng)2～4 d，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，37℃孵育4 h后，將培養(yǎng)板取出，棄掉培養(yǎng)板內(nèi)液體，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，室溫震蕩10 min，溶解結(jié)晶物。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選定490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸描繪細(xì)胞增殖情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ促進(jìn)CFs中SMYD2的表達(dá)

通過(guò)酶消化法和差速貼壁的方法將心肌細(xì)胞和CFs分離，分別給予AngⅡ (50 nM和100 nM)作用48 h后，Western Blot檢測(cè)SMYD2蛋白的表達(dá)水平，qPCR檢測(cè)SMYD2 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示AngⅡ促進(jìn)SMYD2在蛋白和mRNA水平的表達(dá)，并且呈劑量依賴(lài)性(圖1)，提示SMYD2可能參與了CFs的體外增殖過(guò)程。

2.2 降低SMYD2的表達(dá)可抑制CFs增殖和膠原合成

給予AngⅡ(100 nM)作用后，CFs明顯增殖，SMYD2-siRNA則可抑制AngⅡ引起的細(xì)胞增殖(圖2)。qPCR檢測(cè)各組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá)，AngⅡ(100 nM)可促進(jìn)其合成和分泌，SMYD2-siRNA則降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達(dá)(圖3)。

與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01(n=4)圖1 AngⅡ促進(jìn)大鼠CFs中SMYD2蛋白和mRNA表達(dá)

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與SMYD2-siRNA組比較，bP<0.05(n=5)圖2 降低SMYD2的表達(dá)抑制CFs的增殖

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與SMYD2-siRNA組比較，bP<0.05(n=5)圖3 降低SMYD2的表達(dá)抑制CFs的膠原合成

2.3 SMYD2對(duì)CFs增殖和膠原合成作用的分子機(jī)制

在CFs細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SMYD2-siRNA，結(jié)果顯示SMYD2-siRNA組TGF-β1蛋白和mRNA表達(dá)水平下降(圖4)。TGF-β1可促進(jìn)CFs的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的合成和分泌[6]。SMYD2可能通過(guò)影響TGF-β1的表達(dá)水平參與Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的合成。

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與SMYD2-siRNA組比較，bP<0.05(n=5)圖4 降低SMYD2的表達(dá)抑制CFs中TGF-β1蛋白和mRNA水平

3 討論

本研究的結(jié)果表明，AngⅡ可促進(jìn)體外培養(yǎng)CFs中SMYD2的表達(dá)增加，并呈劑量依賴(lài)性，因AngⅡ是CFs生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的重要生物因子，提示SMYD2可能參與CFs的增殖和膠原合成。CFs的過(guò)度增殖、膠原異常沉積分布導(dǎo)致心臟間質(zhì)重構(gòu)，促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生，因此SMYD2可能參與AngⅡ促進(jìn)心肌纖維化發(fā)生的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SMYD2能明顯增加CFs的增殖，以及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原 mRNA的表達(dá)；SMYD2-siRNA則可降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達(dá)，表明SMYD2參與了CFs膠原合成。TGF-β1作為CFs的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的合成和分泌的重要調(diào)控因子，在CFs中過(guò)表達(dá)SMYD2 同樣促進(jìn)TGF-β1蛋白和mRNA水平增加，SMYD2-siRNA可使其表達(dá)水平降低。

AngⅡ誘導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)生，主要機(jī)制是CFs的增殖和膠原蛋白的代謝紊亂及心肌細(xì)胞的肥大。AngⅡ可促進(jìn)CFs向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并且分泌大量的膠原纖維和層粘蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)[7]。AngⅡ可以激活CFs細(xì)胞表面的L型和T型鈣通道，促進(jìn)CFs的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原基因表達(dá)增強(qiáng)。心肌纖維化是膠原合成和降解代謝失調(diào)的結(jié)果，與TGF-β1密切相關(guān)。TGF-β1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、促進(jìn)細(xì)胞增殖等生物功能[8]。TGF-β1可誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的大鼠CFs分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白基因表達(dá)增加。因此，降低TGF-β1的表達(dá)可明顯抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原分泌，可作為心肌纖維化治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)[9]。

表觀遺傳學(xué)修飾異常廣泛存在于疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，其中組蛋白甲基化修飾是研究中的熱點(diǎn)，組蛋白甲基化修飾酶參與調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)功能[10]。SMYD是含有SET結(jié)構(gòu)域和MYND結(jié)構(gòu)域蛋白的家族，是一組重要的賴(lài)氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，已證實(shí)現(xiàn)有SMYD1-5個(gè)家族成員，SMYD主要在胚胎發(fā)育、骨骼肌和心臟發(fā)育中發(fā)揮作用[11-13]。SMYD2對(duì)細(xì)胞增殖的影響不只是依賴(lài)于其對(duì)組蛋白甲基化的調(diào)控，更與SMYD2廣泛調(diào)節(jié)的非組蛋白底物相關(guān)，包括p53、Rb1、PARP1、PTEN、Hsp90和ERα。SMYD2通過(guò)對(duì)這些底物的甲基化修飾調(diào)控這些蛋白的作用，從而發(fā)揮其生理和病理功能。SMYD2可將p53 的K371位點(diǎn)甲基化修飾，從而抑制其相鄰位點(diǎn)的SET7/9的甲基化。而K370位點(diǎn)甲基化是p53乙?；⒓せ钕掠位虮磉_(dá)的必要步驟，因此SMYD2抑制了p53的生物活性。SMYD2抑制了p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這可能是SMYD2參與腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一[14]。SMYD2可催化Rb1的K810位點(diǎn)甲基化，該修飾促進(jìn)了CDK4/CyclinD1復(fù)合體對(duì)Rb1的Ser807/811位點(diǎn)的磷酸化修飾，進(jìn)而阻礙了Rb1與E2F的結(jié)合，促進(jìn)E2F對(duì)下游基因的激活作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。SMYD2與心血管系統(tǒng)疾病的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。SMYD2主要在骨骼肌和心肌細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)骨骼肌的成熟發(fā)揮重要作用，而在小鼠中的研究卻發(fā)現(xiàn)SMYD2對(duì)發(fā)育影響較小[16]。

本研究主要證實(shí)了SMYD2在AngⅡ刺激的CFs細(xì)胞中表達(dá)增加，提示SMYD2參與CFs的增殖和膠原合成過(guò)程。降低SMYD2在CFs中的表達(dá)可明顯抑制CFs的增殖和Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TGF-β1的合成，證實(shí)SMYD2參與了AngⅡ誘導(dǎo)心肌纖維化發(fā)生的病理過(guò)程。但SMYD2對(duì)心肌纖維化發(fā)生的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。本研究?jī)H在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)SMYD2參與調(diào)控心肌纖維化的可能分子機(jī)制，尚缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的證據(jù)，因此需要進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)SMYD2對(duì)TGF-β1調(diào)控。此外，在心血管疾病臨床轉(zhuǎn)化研究中，SMYD2能否作為新型治療靶點(diǎn)也是今后研究的主要方向。

利益沖突：無(wú)