李一倫，張妍妍，余 浩，余 輝，殷全玉，李本銀，李烜楨，李俊朋，吳明作

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院, 河南 鄭州 450002； 2.鄭州市氣象局, 河南 鄭州 450048；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院, 河南 鄭州 450002； 4.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所,河南 鄭州 450002； 5.平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 河南 平頂山 467000)

近年來，我國土壤重金屬污染已經(jīng)引起國內(nèi)外專家學(xué)者的廣泛關(guān)注[1]。Cd是一種毒性極強、難降解、易被植物吸收的重金屬元素，不僅會抑制植物的生長發(fā)育，還會通過食物鏈進入人體并在體內(nèi)蓄積，危害人體健康[2-3]。因此，對Cd污染農(nóng)田進行修復(fù)是目前政府和學(xué)者關(guān)注的熱點問題。傳統(tǒng)的重金屬污染土壤治理措施主要是物理和化學(xué)方法，但這些方法存在成本高、易引起二次污染、破壞土壤結(jié)構(gòu)等缺點，在實際推廣應(yīng)用中受到限制[4]。植物修復(fù)屬于原位修復(fù)技術(shù)，目前已經(jīng)成為修復(fù)重金屬污染土壤的主要手段之一。目前發(fā)現(xiàn)的重金屬超富集植物普遍存在干質(zhì)量小、地域性強等缺點，從而制約了植物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展[5]。

煙草是廣泛種植的經(jīng)濟作物，研究發(fā)現(xiàn)其對Cd具有較強的吸收積累能力，且干質(zhì)量大，環(huán)境適應(yīng)性強，有望用于Cd污染農(nóng)田的修復(fù)[6-8]。EDTA(乙二胺四乙酸)、EDDS(乙二胺二琥珀酸)是經(jīng)常用來強化植物修復(fù)效果的螯合劑，但是EVANGELOU 等[9]發(fā)現(xiàn)這2種物質(zhì)在用于煙草修復(fù)Cd污染時并未收到很好的效果。同時，這些螯合劑在土壤中不易分解，可能會導(dǎo)致二次污染[10]，因此亟待開發(fā)環(huán)境友好的植物修復(fù)強化技術(shù)。

植物根際促生菌是指存在于土壤、植物根際和根表，能間接或直接促進、調(diào)節(jié)植物生長的微生物[11]。植物根際促生菌不僅能夠通過分泌鐵載體、有機酸、生物表面活性劑、植物激素等物質(zhì)改變重金屬的形態(tài)和植物根際環(huán)境，還能夠直接或者間接地促進植物生長發(fā)育并提高植物對重金屬的耐受性[12-13]。目前對于植物根際促生菌的研究主要集中在促進植物生長、減少化肥使用量等方面[14]，但將其用于植物重金屬修復(fù)的研究還不多。鑒于此，本研究比較不同植物根際促生菌劑對煙草生長和富集Cd能力的影響，并對其可能存在的機制進行分析，旨在為利用煙草修復(fù)土壤Cd污染提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試土壤

供試土壤采自河南省新鄉(xiāng)市某Cd污染農(nóng)田，土壤充分混勻后用于試驗。供試土壤基本理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Tab.1 Basic physical and chemical properties of tested soil

1.2 供試材料

供試煙草品種為云煙87，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院提供。供試菌劑為友益君菌劑(由金禾佳農(nóng)生物科技有限公司提供，主要菌種為枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、植物乳桿菌、木霉菌、解淀粉芽孢桿菌等復(fù)合多種益生菌)、光合細(xì)菌菌劑(由河南九邦生物科技有限公司提供，主要菌種為沼澤紅假單胞菌、莢膜紅假單胞菌、球形紅假單胞菌等)、膠凍樣芽孢桿菌菌劑(由河南九邦生物科技有限公司提供)、巨大芽孢桿菌菌劑(由河南九邦生物科技有限公司提供)。

1.3 試驗設(shè)計

采用室內(nèi)盆栽試驗種植煙草，試驗共設(shè)5個處理，分別添加友益君菌劑、光合細(xì)菌菌劑、膠凍樣芽孢桿菌菌劑和巨大芽孢桿菌菌劑，其中，不加任何菌劑的處理為對照(CK)。每盆裝土1 kg，加入菌劑的量分別為友益君菌劑5 g、膠凍樣芽孢桿菌菌劑5 g、巨大芽孢桿菌菌劑5 g、光合細(xì)菌菌劑5 mL，每個處理4個重復(fù)，共20盆。然后將培養(yǎng)至四葉一心并且大小一致的煙苗移栽至盆缽中。白天光照10 h，溫度28 ℃；夜晚14 h，溫度18 ℃；濕度為70%，培育60 d。

1.4 測定項目

煙草株高的測定：將直尺貼著煙草基部量到頂部最高位置，讀數(shù)即為株高(cm)。

煙草干質(zhì)量的測定： 將煙草樣品沖洗干凈，晾干表面水分，用牛皮信封封好，放入烘箱105 ℃殺青10 min，隨后調(diào)至75 ℃烘72 h至恒質(zhì)量。取出信封和煙草，放入干燥器中冷卻至室溫，稱干質(zhì)量(DW)。

土壤pH值的測定：采用去離子水浸提(水土質(zhì)量比為2.5∶1)，并采用pH計(上海雷磁，PHSJ-5型)進行測定。

煙草光合效率的測定：采用光合儀(CIRAS-3，PP SYSTEMS)進行測定。

煙草Cd含量的測定：將煙草植株樣品的地上部和地下部用自來水沖洗干凈，再用去離子水沖洗4～5次，晾干表面水分，用牛皮信封封好，放入烘箱105 ℃殺青，隨后調(diào)至65 ℃烘72 h。烘干后的樣品用植物粉碎機粉碎，然后采用微波消解，消解液為 HNO3-HClO4(體積比為3∶1)，采用原子吸收分光光度計測定Cd含量(日本日立公司，Z-2000)。

土壤Cd含量的測定：在煙草收獲后采集盆缽中土樣，風(fēng)干后過0.154 mm孔徑篩，采用微波消解，消解液為 HNO3-HClO4(體積比為3∶1)，采用原子吸收分光光度計測定Cd含量(日本日立公司，Z-2000)。

土壤有效態(tài)Cd檢測：參照國家標(biāo)準(zhǔn)《土壤環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》(HJ/T 166—2004)進行，具體步驟是，采用DTPA溶液浸提(土液質(zhì)量比為1∶2.5，振蕩2 h)，采用原子吸收分光光度計測定(日本日立公司，Z-2000)。

土壤有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法檢測；有效磷含量采用NaHCO3溶液浸提，鉬銻抗比色法檢測；有效鉀含量采用醋酸銨浸提，火焰光度計(上海傲譜，UV7500)檢測；全氮含量測定采用凱氏定氮法。所用試劑均為優(yōu)級純。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物根際促生菌劑對煙草富集及轉(zhuǎn)運Cd能力的影響

通過分析煙草植株地上部和地下部的Cd含量發(fā)現(xiàn)(圖1A)，對照條件下，煙草地上部、地下部Cd含量分別達(dá)到34.6、12.5 mg/kg，遠(yuǎn)高于供試土壤中Cd含量的本底值(3.45 mg/kg)，表明煙草對Cd具有較強的富集能力；施用4種植物根際促生菌劑均促進了煙草對Cd的富集，其中促進作用最大的為光合細(xì)菌菌劑處理，使煙草地上部、地下部Cd含量分別提高到47.2、19.1 mg/kg，與對照相比分別提高了36.4%、52.4%；其次為友益君菌劑、巨大芽孢桿菌菌劑和膠凍樣芽孢桿菌菌劑處理。

在本研究中，所有處理的轉(zhuǎn)運系數(shù)均大于1(圖1B)，同時發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌菌劑和友益君菌劑處理下的煙草Cd轉(zhuǎn)運系數(shù)大于對照，而膠凍樣芽孢桿菌菌劑和光合細(xì)菌菌劑處理Cd轉(zhuǎn)運系數(shù)小于對照，表明根際促生菌不僅能夠促進煙草對Cd的運輸還能影響Cd在煙草中的分布。

圖1 不同植物根際促生菌劑對煙草Cd含量及轉(zhuǎn)運的影響
Fig.1 Effects of different plant growth promoting rhizobacteria on Cd content and transport coeffcient in tobacco

2.2 植物根際促生菌劑對植煙土壤有效Cd含量及pH值的影響

為了明確菌劑對土壤中Cd的活化作用，研究分析了土壤有效Cd含量(圖2A)，結(jié)果表明，除巨大芽孢桿菌菌劑處理外，與對照相比，其他菌劑均提高了土壤中有效Cd含量，其中光合細(xì)菌菌劑處理下的土壤有效Cd含量最高，達(dá)0.5 mg/kg，其次為友益君菌劑和膠凍樣芽孢桿菌菌劑處理，因此認(rèn)為光合細(xì)菌菌劑對土壤中Cd的活化作用最強。

施用不同菌劑處理盡管降低了土壤的pH值(圖2B)，但是幅度較小。其中，友益君菌劑、巨大芽孢桿菌菌劑處理下的土壤pH值下降較為明顯，分別下降到7.5、7.6，而光合細(xì)菌菌劑處理對土壤pH值的影響不大。

2.3 植物根際促生菌劑對煙草生理指標(biāo)的影響

對照條件下，煙草植株的地上部、地下部的干質(zhì)量分別為0.9 、0.4 g，而施用不同菌劑均提高了煙草的干質(zhì)量，其中光合細(xì)菌菌劑處理的煙草干質(zhì)量最大，地上部、地下部干質(zhì)量分別達(dá)到1.8、0.8 g(圖3A)。

圖2 不同植物根際促生菌劑對植煙土壤有效Cd含量及pH值的影響Fig.2 Effects of different plant growth promoting rhizobacteria on available Cd content and pH value of tobacco-planted soil

通過對煙草株高進行測定發(fā)現(xiàn)(圖3B)，所有菌劑均增加了煙草的株高，其中光合細(xì)菌菌劑處理對煙草株高的促進作用最大，株高達(dá)18.8 cm。

通過分析葉綠素含量發(fā)現(xiàn)(圖3C)，施用植物根際促生菌劑均可以提高煙草葉綠素含量[15]，其中，巨大芽孢桿菌菌劑處理對煙草葉綠素含量提升作用最大，培養(yǎng)60 d時與對照相比提高了24.0%，膠凍樣芽孢桿菌菌劑、光合細(xì)菌菌劑和友益君菌劑處理次之。

通過分析煙草凈光合速率發(fā)現(xiàn)(圖3D)，施用膠凍樣芽孢桿菌菌劑、巨大芽孢桿菌菌劑和友益君菌劑處理的煙草凈光合速率在培養(yǎng)期內(nèi)均高于對照，而施用光合細(xì)菌菌劑處理在煙草培養(yǎng)初期(20 d)凈光合速率低于對照，在培養(yǎng)中后期(40 d和60 d)高于對照，整體來說，施用菌劑促進了煙草光合效率和葉綠素含量的提高。

圖3 不同植物根際促生菌劑對煙草生理生化指標(biāo)的影響
Fig.3 Effects of different plant growth promoting rhizobacteria on physiological and biochemical indexes of tobacco

2.4 植物根際促生菌劑對植煙土壤養(yǎng)分含量的影響

通過分析植煙土壤養(yǎng)分含量發(fā)現(xiàn)，施用植物根際促生菌劑能夠提高土壤中有機質(zhì)含量(圖4A)，其中，膠凍樣芽孢桿菌和光合細(xì)菌菌劑處理的土壤有機質(zhì)含量較高，分別達(dá)37.13、35.71 g/kg，巨大芽孢桿菌、友益君菌劑處理次之。施用植物根際促生菌劑能夠有效增加土壤總氮含量(圖4B)。其中，施用光合細(xì)菌菌劑處理的土壤總氮含量最高，達(dá)2 070.5 mg/kg，膠凍樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌菌劑處理次之。施用菌劑均提高了土壤有效磷含量(圖4C)，其中，膠凍樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、光合細(xì)菌菌劑處理最為明顯，較對照分別提高了41.3%、41.4%、30.0%。通過分析土壤中有效鉀含量發(fā)現(xiàn)(圖4D)，供試菌劑未明顯提高土壤有效鉀含量，表明這些菌劑沒有解鉀功能。

2.5 植物根際促生菌劑對煙草Cd總含量的影響

通過分析煙草Cd總含量發(fā)現(xiàn)(圖5)，施用植物根際促生菌劑的煙草Cd總含量均高于對照，其中，光合細(xì)菌菌劑處理的Cd總含量最高，達(dá)102.06 mg，較對照提高了191.2%，膠凍樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、友益君菌劑處理的Cd總含量次之。因此，復(fù)合光合細(xì)菌菌劑對煙草Cd總含量的促進作用最大。

圖4 不同植物根際促生菌劑對植煙土壤養(yǎng)分含量的影響Fig.4 Effects of different plant growth promoting rhizobacteria on nutrient content of tobacco-planted soil

圖5 不同植物根際促生菌劑對煙草Cd總含量的影響Fig.5 Effects of different plant growth promoting rhizobacteria on total Cd content in tobacco

3 結(jié)論與討論

具有較強的Cd富集能力是菌劑成功進行植物修復(fù)的前提。本研究發(fā)現(xiàn),4種供試菌劑均提高了煙草對Cd的富集能力，其中以光合細(xì)菌菌劑的促進作用最大。

轉(zhuǎn)運系數(shù)可表征Cd在植物中由地下部到地上部的運輸能力[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，煙草具有較強的向上運輸能力，地上部(主要為葉)是Cd的主要積累器官，這與前人的研究結(jié)果相似[17-18]。同時發(fā)現(xiàn)，植物根際促生菌不僅可以促進煙草對Cd的富集，同時還可以影響Cd在煙草中的分布，其中光合細(xì)菌菌劑對煙草吸收Cd的促進作用最大。

有研究表明，植物對Cd的富集能力與土壤中有效Cd含量呈一定的正相關(guān)性[19]。本研究表明，光合細(xì)菌、友益君、膠凍樣芽孢桿菌菌劑處理均提高了土壤有效Cd含量，其中，以光合細(xì)菌菌劑處理效果較好，這可能是光合細(xì)菌菌劑大幅度提高煙草對Cd富集能力的主要原因。

通常認(rèn)為,土壤pH值是影響有效Cd含量的重要因素[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，友益君、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌菌劑處理降低了土壤pH值，而光合細(xì)菌菌劑處理對土壤pH值的影響不大，因此推測光合細(xì)菌活化Cd的機制可能并不是通過降低土壤pH值實現(xiàn)的。事實上，微生物活化土壤重金屬的機制是多樣的。例如，李敏等[21]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌等一些解磷菌可以通過分泌氨基酸、有機酸等物質(zhì)從而提高土壤有效態(tài)重金屬含量；一些微生物產(chǎn)生的鐵載體可與重金屬結(jié)合形成復(fù)合物，從而提高重金屬的可溶性[22-23]；此外，一些微生物通過提高可溶性有機質(zhì)含量來促進重金屬的溶解[24]。在本研究中，所采用菌劑很可能也是通過以上類似的機制實現(xiàn)土壤Cd的活化。

干質(zhì)量的大小是決定植物吸收重金屬的一個重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，施用不同菌劑均提高了煙草的地上部和地下部干質(zhì)量、株高、葉綠素含量和凈光合速率，其中，葉綠素含量和凈光合速率是植物光合作用的重要指標(biāo)，反映了植物對有機物的積累能力，這可能是導(dǎo)致煙草干質(zhì)量增加的一個重要原因。根際促生菌對植物生長的改善作用已被學(xué)界認(rèn)可，例如，曾益波[25]發(fā)現(xiàn)，光合細(xì)菌處理后的水稻種子與對照相比,其芽長和根長均可增長約2.5倍，同時光合細(xì)菌也能促進幼苗的生長,使水稻苗期莖稈比對照高36%；馬瑩等[26]研究發(fā)現(xiàn)，植物根際促生菌能通過自身分泌的固氮酶直接將大氣中的氮還原成NH4+，增加植物的生物固氮量，從而提高植物產(chǎn)量和蛋白質(zhì)含量；朱金英等[27]發(fā)現(xiàn)，施用膠凍樣芽孢桿菌使棉花產(chǎn)量提高了17.28%；范瑛閣等[28]的黃瓜幼苗期試驗結(jié)果表明，經(jīng)芽孢桿菌稀釋液處理后的黃瓜葉片，其葉綠素含量與對照相比有所增加；刑嘉韻等[29]發(fā)現(xiàn)，巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌混合菌劑使塊莖形成期馬鈴薯葉片凈光合速率提高了39%。關(guān)于根際促生菌促進植物生長的作用機制目前也已闡明[30-31]，其機制主要包括:①固氮作用。根際促生菌能通過自身分泌固氮酶，直接將大氣中的氮還原成植物可利用的生物氮，從而促進植物的生長發(fā)育。②溶磷作用。根際促生菌可分泌有機酸來溶解難溶性無機磷酸鹽，或分泌胞外磷酸酶將難溶性的磷酸脂等有機磷消解，釋放出生物有效磷。③解鉀作用。某些根際促生菌具有分解鉀礦物的能力，能有效提高土壤中有效鉀的含量。④供鐵作用。某些根際促生菌能夠分泌親和性和專一性的鐵載體，能夠與鐵螯合形成復(fù)合物后被植物吸收利用。⑤分泌植物生長調(diào)節(jié)劑。某些根際促生菌可以分泌生長素吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)或提高植物的抗病能力，直接或間接地促進植物生長發(fā)育。

土壤有機質(zhì)是指存在于土壤中的所有含碳的有機物質(zhì)，是反映土壤肥力的重要指標(biāo)[32]。本研究通過分析植煙后土壤有機質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)，施用植物根際促生菌劑能夠提高土壤中有機質(zhì)含量，原因很可能是：一方面，菌劑本身可能貢獻(xiàn)了一部分有機質(zhì)；另一方面，菌劑可能通過刺激植物生長，提高了根系分泌物的量，從而增加了根際土壤有機質(zhì)。

氮素是作物體內(nèi)合成蛋白質(zhì)、氨基酸等生物分子的原料。本研究發(fā)現(xiàn)，施用植物根際促生菌劑能夠有效增加土壤總氮含量，其中以光合細(xì)菌的固氮效果最佳。事實上，光合細(xì)菌的固氮功能已經(jīng)被證實。例如，李先磊[33]研究發(fā)現(xiàn)，光合細(xì)菌能通過自身分泌的固氮酶直接將大氣中的氮還原成NH4+，從而增加植物的生物固氮量，另外還發(fā)現(xiàn)，光合細(xì)菌除了本身的固氮作用，還可以促進土壤中固氮菌的增殖[34]。

磷元素是植物生長必需的大量營養(yǎng)元素。研究發(fā)現(xiàn)，施用植物根際促生菌劑均提高了植煙土壤有效磷含量，這很可能與植物根際促生菌具有解磷作用有關(guān)[35-36]。聶登壁等[13]認(rèn)為，植物根際促生菌的解磷機制一方面是通過分泌有機酸溶解了土壤中的不溶性磷，另一方面通過降低土壤pH值加快了磷的溶解，來提高土壤中磷的利用率，從而促進植物對磷元素的吸收利用。

通過分析煙草Cd總含量發(fā)現(xiàn)，施用植物根際促生菌劑對煙草Cd總含量有一定的促進作用。在重金屬污染農(nóng)田修復(fù)中，植物對重金屬的富集能力和干質(zhì)量均是影響修復(fù)效率的重要因素。在一項Cd超積累植物(遏藍(lán)菜)和非超積累植物(煙草和向日葵)的比較試驗中，盡管遏藍(lán)菜對Cd的富集能力高于煙草和向日葵，但是由于煙草和向日葵具有更大的干質(zhì)量，因此對Cd的總?cè)コ矢遊37-39]。因此，提高植物干質(zhì)量也是改善修復(fù)效果的重要措施。本研究中，光合細(xì)菌菌劑處理對煙草干質(zhì)量的提升作用最大，同時可以促進煙草對Cd的富集，這意味著采用光合細(xì)菌作為煙草修復(fù)Cd污染土壤的強化措施是可行的。

由以上結(jié)果可知，4種植物根際促生菌劑均可以提高煙草地上部和地下部Cd含量，其中，光合細(xì)菌菌劑的提升作用最大，較對照分別提高了36.4%、52.4%。不同菌劑提高煙草對Cd富集能力的機制是不同的，其中，膠凍樣芽孢桿菌、友益君菌劑處理可能通過降低土壤pH值進而提高土壤有效Cd含量；而光合細(xì)菌菌劑處理可能是通過分泌螯合物質(zhì)，進而提高了土壤Cd的可溶性。4種植物根際促生菌劑均可以促進煙草生長，并提高了煙草葉綠素含量和凈光合速率，其中，光合細(xì)菌菌劑處理對煙草的促生效果最明顯，使煙草干質(zhì)量、株高分別提高了100.0%、11.0%。膠凍樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和光合細(xì)菌提高了土壤有機質(zhì)、總氮、有效磷含量，這可能是供試菌劑促進煙草生長的主要原因。4種植物根際促生菌劑均不同程度地提高了煙草對Cd的富集，其中光合細(xì)菌效果最為明顯，因此認(rèn)為，施用光合細(xì)菌菌劑可以作為煙草修復(fù)重金屬污染土壤的有效強化措施。