王仁杰，蔣 燚，朱 凡，唐 正，劉雄盛，姜 英，王 勇

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧 530002；2.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410004）

光合作用對植物的生長發(fā)育具有重要意義，植物的光合作用包括光反應(yīng)和暗反應(yīng)2個階段，高等植物的光反應(yīng)由光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）、細(xì)胞色素b6f復(fù)合物（Cyt b6f）、光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）以及ATP合成酶復(fù)合物共同參與，通過光合電子傳遞及光合磷酸化等過程完成電子從H2O到NADP+的傳遞并產(chǎn)生ATP、釋放O2[1]。其中，PSⅠ復(fù)合物在光合電子傳遞鏈的還原端作為質(zhì)體藍(lán)素-鐵氧還蛋白氧化還原酶起作用。PSⅠ除了參與線性傳遞，還參與圍繞PSⅠ的循環(huán)電子傳遞和水循環(huán)[2]等。早期研究認(rèn)為PSⅡ是逆境條件下光合機(jī)構(gòu)中最敏感的組分，而PSⅠ較穩(wěn)定[3]。直到1994年，在研究低溫脅迫對高等植物光系統(tǒng)的抑制作用時首次發(fā)現(xiàn)黃瓜（Cucumis sativus）葉片中PSⅠ的光抑制現(xiàn)象，且在該脅迫下，光抑制的主要位點是PSⅠ而非PSⅡ[4]，現(xiàn)已證明這一現(xiàn)象在高等植物中普遍存在[5-6]。當(dāng)PSⅠ發(fā)生光抑制后其活性往往需要經(jīng)過長時間才能恢復(fù)，因此，PSⅠ活性的緩慢恢復(fù)最終導(dǎo)致PSⅠ成為限制光合作用的重要因素[7]。近年來，隨著PSⅠ活體測定技術(shù)的發(fā)展，對PSⅠ光抑制和光破壞防御機(jī)制的研究更加深入[8-10]。本文介紹了利用820 nm光吸收曲線技術(shù)測定PSⅠ的光化學(xué)效率、環(huán)式電子傳遞能力和能量分配的基本原理及其應(yīng)用研究進(jìn)展，以期為820 nm光吸收曲線技術(shù)在其它條件下對PSⅠ性能影響提供理論和技術(shù)支撐。

1 820 nm光吸收曲線技術(shù)

820 nm光吸收曲線能對葉片進(jìn)行快速和無損傷測定，因此被廣泛應(yīng)用于PSⅠ原初光化學(xué)反應(yīng)檢測[11]。測定時，先將植物葉片進(jìn)行完全的暗適應(yīng)，使PSⅠ反應(yīng)中心（P700）及其原初電子供體質(zhì)藍(lán)素（PC）均處于還原態(tài)，然后對植物葉片進(jìn)行照光處理，PSⅠ開始進(jìn)行原初光化學(xué)反應(yīng)，P700和PC失去電子，分別變?yōu)檠趸瘧B(tài)的P+700和PC+，兩者均能吸收820 nm波長的光[12]。此時820 nm光吸收曲線處于下降階段，若有電子到達(dá)PSⅠ反應(yīng)中心，P+700和PC+則被重新還原為P700和PC，此時820 nm光吸收曲線處于上升階段。除了P+700和PC+能吸收820 nm波長的光，植物的其它組織也能吸收820 nm波長的光，如植物葉片組織結(jié)構(gòu)的變化也會影響P+700和PC+對820 nm光的吸收作用。因此，研究中820 nm光吸收曲線多用MR/MR0表示，以排除其它因素對820 nm光吸收的影響，其中MR0為開始照光時的初始熒光值，MR為任意時刻的熒光值。此時，MR/MR0比值的變化還能反映P700和PC的氧化還原狀態(tài)的變化[13]，820 nm光吸收曲線常使用多功能植物效率分析儀（M-PEA,Hansatech,UK）進(jìn)行測定，根據(jù)暗適應(yīng)和光照強(qiáng)度及時間等參數(shù)設(shè)定的不同，820 nm光吸收曲線呈現(xiàn)不同的形態(tài)，可以從不同角度反應(yīng)PSⅠ內(nèi)部的變化。

2 PSⅠ實際光化學(xué)效率的測定原理及應(yīng)用

圖1 紅光照射下的820 nm光吸收曲線Fig.1 Light absorbance at 820 nm under illumination of red light

紅光照射條件下同時激發(fā)PSⅡ與PSⅠ，該條件下測定的PSⅠ活性，包括了PSⅡ的作用。因此，紅光條件下，測定PSⅠ的活性更有實際意義[14]。完全暗適應(yīng)的植物葉片組織照射紅光后，P+700和PC+的比例增加，820 nm光吸收增加，820 nm光信號檢測值降低。當(dāng)來自PSⅡ的電子到達(dá)P+700和PC+后，二者均被還原，820 nm光吸收減少，820 nm光信號檢測值降低變緩。當(dāng)P700和PC的氧化還原速率相同時，820 nm光信號檢測值停止下降，隨著照光時間的增加，當(dāng)P+700和PC+的還原速率超過P700和PC的氧化速率時，820 nm光信號檢測值開始上升[15]。Strasser等[13]利用MR/MR0快速下降階段的振幅（ΔIR/I0）研究PSⅠ的實際光化學(xué)效率，即自然條件下PSⅠ的活性，該方法側(cè)重于反映PSⅠ整體性能，多數(shù)研究用該參數(shù)直接衡量PSⅠ的真實活性，研究表明巴爾干苣苔（Haberlea rhodopensis）在干旱脅迫前期，820 nm光吸收曲線下降幅度增大，上升幅度減少，干旱脅迫后期，820 nm的光吸收曲線下降幅度減小，上升幅度基本為零，表明干旱前期PSⅠ活性的變化是由PSⅡ到達(dá)PSⅠ的電子逐漸減少導(dǎo)致的，后期則是由PSⅠ自身受損導(dǎo)致的；也有研究用820 nm光吸收曲線的最大下降速率（VPSⅠ）和最大上升速率（VPSⅡ-PSⅠ）來反映PSⅠ自身氧化還原的速率和PSⅡ到PSⅠ電子傳遞速率的變化，進(jìn)而計算PSⅡ的電子傳遞速率（VPSⅡ）[16]。通過測定紅光激發(fā)下的820 nm光吸收曲線并運用該方法計算相關(guān)參數(shù)，結(jié)果表明，干旱脅迫下平邑甜茶（Malus hupehensis）葉片經(jīng)過硅處理后，VPSⅠ和VPSⅡ-PSⅠ均顯著大于對照，該研究結(jié)果說明平邑甜茶根部施硅肥可以提高PSⅠ復(fù)合體的活性，促進(jìn)PSⅡ到PSⅠ之間光合電子傳遞的過程，從而提高葉片的光化學(xué)效率，避免過剩光能產(chǎn)生活性氧傷害葉片的光合機(jī)構(gòu)[17]。

3 PSⅠ最大光化學(xué)效率的測定原理及應(yīng)用

自然條件下不存在單獨遠(yuǎn)紅光激發(fā)產(chǎn)生的光化學(xué)反應(yīng)，只有通過儀器激發(fā)才能單獨使PSⅠ發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，遠(yuǎn)紅光下測定的指標(biāo)更能體現(xiàn)PSⅠ絕對真實的狀態(tài)。在完全暗適應(yīng)的植物綠色組織照射遠(yuǎn)紅光后，P+700和PC+的比例增加，對820 nm光吸收增加，反射減少，檢測到的820 nm光信號降低。遠(yuǎn)紅光激發(fā)下，只有PSⅠ發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，PSⅡ中未發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，即PSⅡ反應(yīng)中心無電子到達(dá)P+700和PC+，820 nm光吸收持續(xù)增加，直至P700和PC幾近完全氧化為P+700和PC+，820 nm光信號降低至最低點，遠(yuǎn)紅光下測定820 nm光吸收的相對振幅（ΔIF/Io）作為衡量PSⅠ最大光化學(xué)效率的指標(biāo)[18]。Bukhov等[19]在4℃的低溫環(huán)境下暗適應(yīng)30 min后，用300 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)測定黃瓜葉片內(nèi)部PSⅠ的活性，研究表明，光抑制下敵草隆或甲基紫精有助于電子從質(zhì)體醌（PQ）向P700傳遞，且影響P+700再還原過程的主要因素為光照強(qiáng)度太低，而不是低溫脅迫。李耕 等[20]利 用 PEA-Senior（Hansatech，UK）將 玉 米（Zea mays）葉片暗適應(yīng)15 min，然后照射10 s的遠(yuǎn)紅光進(jìn)行激發(fā)，測定820 nm光吸收曲線，計算PSⅠ最大光化學(xué)效率，反映Cd脅迫下玉米葉片PSⅠ的客觀性能；結(jié)合PSⅡ和羧化反應(yīng)的變化，表明Cd脅迫造成玉米葉片光合作用過程中光能-電能-化學(xué)能的轉(zhuǎn)化受阻，光合還原力NADPH積累，PSⅠ電子積累量過剩，最終導(dǎo)致其性能下降；暗反應(yīng)中羧化效率的降低也阻礙了光系統(tǒng)中電子的傳遞，造成電子在PSⅠ內(nèi)大量積累，玉米葉片光系統(tǒng)中PSⅠ性能下降的速率快于PSⅡ，最終導(dǎo)致2個光系統(tǒng)間的協(xié)調(diào)性下降。

4 PSⅠ環(huán)式電子傳遞能力的測定原理及應(yīng)用

圍繞PSⅠ的環(huán)式電子傳遞是維持光合作用高效進(jìn)行的保護(hù)機(jī)制[21]。PSⅠ受損主要源于超氧陰離子在PSⅠ受體側(cè)的積累，引起PSⅠ反應(yīng)中心鐵硫蛋白的過度還原[22]。而圍繞PSⅠ的環(huán)式電子流可以將PSⅠ處過多的電子傳遞給其他的電子載體，減少PSⅠ壓力，起到保護(hù)PSⅠ的作用[23]。當(dāng)經(jīng)過充分的暗適應(yīng)后，用遠(yuǎn)紅光照射時，最初電子從PSⅠ到達(dá)NADP＋，但經(jīng)過長時間的遠(yuǎn)紅光激發(fā)后，PSⅠ內(nèi)部電子過剩時，PSⅠ內(nèi)產(chǎn)生的環(huán)式電子鏈將電子從NADP＋重新傳遞到P700和PC，使 P+700和 PC+再次還原，以免PSⅠ內(nèi)部由于過氧化而遭到損傷。此時，遠(yuǎn)紅光激發(fā)下，820 nm光吸收曲線快速上升的過程反映了PSⅠ環(huán)式電子傳遞能力的大小。利用該原理，楊程[24]在研究草酸根離子處理對煙草（Nicotiana tabacum）葉片環(huán)式電子傳遞的影響時，先將煙草葉片進(jìn)行充分暗適應(yīng)，照射20 s的遠(yuǎn)紅光后，關(guān)閉光源，得到一條快速上升的820 nm光吸收曲線，其上升速率用來反映環(huán)式電子傳遞的活性，研究表明K2C2O4處理煙草葉片后，820 nm光吸收曲線上升速率顯著低于KCl處理和對照葉片，這表明K2C2O4對煙草葉片環(huán)式電子傳遞具有顯著的抑制作用，環(huán)式電子傳遞能力的下降表明光合驅(qū)動力下降，光保護(hù)機(jī)制受到破壞。

5 PSⅠ內(nèi)部能量分配的測定原理及應(yīng)用

研究表明PSⅠ吸收光能的途徑為主要耗散途徑，包括光化學(xué)淬滅引起的能量耗散（Y（Ⅰ））、PSⅠ供體側(cè)限制引起的能量耗散（Y（ND））以及PSⅠ受體側(cè)限制引起的能量耗散（Y（NA）），3者之和等于1[25]。通過能量比例的分配可以了解PSⅠ對光能的利用和耗損以及PSⅠ內(nèi)部是否受到光損傷。Se?jima等[26]用2 000 μmol·m-2·s-1的短脈沖光（300 ms），每10 s的頻率照射低氧狀態(tài)下的向日葵（Helianthus annuus）葉片，結(jié)果表明葉片Y（Ⅰ）降低，Y（NA）升高，Y（ND）在照射期間基本沒有變化，說明低氧狀態(tài)下首先限制PSⅠ供體側(cè)的性能。在此研究的基礎(chǔ)上，梁英等[27]利用M-PEA植物效率儀（Hansatech，UK）測定820 nm光吸收曲線，系統(tǒng)地研究在持續(xù)光處理和頻閃光處理下小麥（Triticum aestivum）葉片PSⅠ內(nèi)部不同的能量分配方式，研究表明持續(xù)光處理下小麥葉片中PSⅠ的能量分配基本沒有發(fā)生變化，而頻閃光處理下小麥葉片中PSⅠ的能量分配表現(xiàn)為Y（Ⅰ）顯著降低，Y（NA）顯著升高，Y（ND）保持穩(wěn)定，PSⅠ供體側(cè)性能受到限制。

6 總結(jié)與展望

820 nm光吸收曲線技術(shù)能快速和無損傷地測定PSⅠ內(nèi)光能的利用率、光保護(hù)機(jī)制、是否受到光損傷及引起受傷的作用位點，被廣泛應(yīng)用于低溫弱光脅迫、干旱脅迫和酸脅迫等研究，而對重金屬和土壤鹽堿化等非生物因子脅迫下PSⅠ性能還需進(jìn)一步研究[28]。雖然利用820 nm光吸收曲線技術(shù)可以保持葉片活性，進(jìn)行長期連續(xù)性監(jiān)測，但無法揭示PSⅠ反應(yīng)中心各種蛋白的結(jié)構(gòu)與功能在脅迫下的具體變化，因此應(yīng)結(jié)合分子生物學(xué)和生物化學(xué)等多個學(xué)科，共同研究揭示PSⅠ變化機(jī)理[29-30]，為生態(tài)修復(fù)中篩選抗性植物[31]、培育高產(chǎn)耐性植物及監(jiān)測環(huán)境污染對光合作用影響等方面提供理論基礎(chǔ)。