許麗娟 王升平 雷平 王玉梅 于志敏 李榮

摘 要：為了規(guī)模化生產(chǎn)除臭酵母菌JM-1，以菌體活菌數(shù)為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：酵母菌JM-1的最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度30℃，初始pH值 5.0，接種量4%，500 mL三角瓶裝液量150 mL。在此條件下培養(yǎng)24 h，釀酒酵母的發(fā)酵菌數(shù)超過(guò)7.42×108 CFU/mL，與優(yōu)化前的6.11×108 CFU/mL相比較，活菌數(shù)提高了21.1%。

關(guān)鍵詞：酵母菌;發(fā)酵條件;正交試驗(yàn);發(fā)酵菌數(shù)

中圖分類號(hào)：Q939.99文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-060X（2020）03-0001-03

Abstract： In order to obtain the optimal fermentation condtions of a strain of JM-1， the fermentation conditions were optimized by single?factor experiment and orthogonal experiment， using the number of viable bacteria in the fermentation as an index. The optimal fermentation conditions were： culture temperature 30℃， initial pH value 5.0， inoculum size 4%， and liquid filling quantity 150 mL in the 500 mL?conical flask. In these conditions， the number of viable bacteria exceed 7.42×108 CFU/mL， which was increased by 21.1% compared to that before optimization.

Key words： saccharomycetes; fermentation conditions; orthogonal experiment; the number of viable bacteria

隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的結(jié)構(gòu)調(diào)整，養(yǎng)殖業(yè)朝著規(guī)?；⒓s化的方向快速發(fā)展。但由其規(guī)模化養(yǎng)殖所產(chǎn)生的大量廢棄物引起的惡臭污染卻成為主要污染源[1]。它不僅影響畜禽的正常生長(zhǎng)，而且還影響?zhàn)B殖區(qū)及周邊農(nóng)村的生態(tài)環(huán)境，已成為制約畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸[2]。美國(guó)、德國(guó)等一些發(fā)達(dá)國(guó)家在幾十年前就開(kāi)始對(duì)惡臭污染進(jìn)行了研究和治理，取得了較多的成果[3]。近年來(lái)，我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)雖然在廢棄物無(wú)害化處理和資源化利用方面取得了明顯的成果，但臭氣污染問(wèn)題卻未得到解決[4]。養(yǎng)殖場(chǎng)的惡臭氣體對(duì)人畜健康影響最大的主要是氨氣（NH3）和硫化氫（H2S）。這些有害氣體如果得不到及時(shí)處理或處理不徹底，將會(huì)給養(yǎng)殖人員帶來(lái)不快、引起人和家畜的呼吸道疾病，而且進(jìn)入大氣后會(huì)造成酸雨和增加自然生態(tài)系統(tǒng)中氮的負(fù)荷，具有大氣污染和有害氣體污染兩重性。因此，如何有效的減少養(yǎng)殖場(chǎng)的惡臭成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。

目前惡臭治理的方法有化學(xué)法、物理法和生物除臭法，或是這幾種方法的組合。而生物除臭法因具有廣泛適用范圍、較低的運(yùn)行費(fèi)用、便于維護(hù)管理以及不會(huì)產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)，成為脫臭技術(shù)的發(fā)展方向[5]。

酵母菌在有氧或無(wú)氧的條件下都能生存，具有良好的生態(tài)適應(yīng)性。它在厭氧條件下產(chǎn)生的乙醇能有效抑制有害微生物的活動(dòng)，同時(shí)散發(fā)出的酒香味還可以掩蓋部分臭味[1]，因此其可在養(yǎng)殖場(chǎng)惡臭氣體治理方面發(fā)揮重要作用。在前期研究的基礎(chǔ)上，以前期篩選到的除臭酵母JM-1為材料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)初步優(yōu)化其發(fā)酵條件，以期為菌劑的規(guī)?；a(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌 種 試驗(yàn)所用除臭酵母為釀酒酵母（JM-1），由湖南省微生物研究院環(huán)保微生物室自行分離和保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：葡萄糖 20.0 g/L，酵母膏 10.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，蒸餾水配制，pH值6.2～6.4;發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖 2%，磷酸二氫鉀 0.1%，氯化鈉 0.01%，硫酸鎂 0.05%，麥芽汁 0.3%，硫酸銨 0.5%，氯化鈣 0.01%，酵母浸膏 0.02%，其余為水，pH值6.0～6.2。

1.2 除臭酵母JM-1最佳發(fā)酵條件的確定

1.2.1 最佳培養(yǎng)溫度的確定 將酵母JM-1按1%接種量接于裝有100 mL YPD培養(yǎng)基容量為500 mL的三角瓶中，分別置于20、25、30、35、40 ℃5個(gè)不同溫度，轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床培養(yǎng)24 h，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)活菌數(shù)。

1.2.2 最佳初始pH值的確定 將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，按1%的接種量進(jìn)行接種，選擇單因素試驗(yàn)確定的最佳溫度，180 r/min培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)活菌數(shù)。

1.2.3 最佳接種量的確定 在獲得最佳初始pH值和培養(yǎng)溫度以后，分別按照2%、4%、6%、8%、10%的接種量進(jìn)行接種，在單因素試驗(yàn)確定的最佳溫度，180 r/min條件下培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)活菌數(shù)。

1.2.4 最佳裝液量的確定 按最佳接種量分別接入裝有10、100、150、200、250 mL YPD培養(yǎng)基容量為500 mL的三角瓶中，選擇最佳溫度，180 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3 除臭酵母JM-1發(fā)酵條件正交優(yōu)化試驗(yàn)

發(fā)酵條件優(yōu)化采用4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，共設(shè)有9個(gè)處理，每個(gè)處理有3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇培養(yǎng)溫度、初始pH值、接種量、裝液量做正交試驗(yàn)，篩選出優(yōu)化組合。

1.4 活菌數(shù)

活菌數(shù)采用平板涂布法計(jì)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 最佳培養(yǎng)溫度 不同溫度對(duì)酵母JM-1生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖1所示，JM-1在25～35℃內(nèi)生長(zhǎng)良好，菌體數(shù)也較高，在30℃時(shí)菌體數(shù)最高，為5.85×108 CFU/mL。低于或高于該溫度范圍，菌體長(zhǎng)勢(shì)差，菌體數(shù)量低，這可能是由于溫度較低時(shí)，微生物生長(zhǎng)緩慢，代謝活性差，因此菌體量少;高溫時(shí)，菌體的代謝活動(dòng)受到抑制，從而影響菌株的生長(zhǎng)和繁殖，導(dǎo)致菌量少。從圖1可看出，JM-1的最佳生長(zhǎng)溫度為30℃。

2.1.2 最佳初始pH值 由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為7.0時(shí)，JM-1菌株長(zhǎng)勢(shì)差;而初始pH值為5.0時(shí)，菌體生長(zhǎng)最好，活菌數(shù)達(dá)6.00×108 CFU/mL;且初始pH值為3.0～4.0時(shí)，菌體生長(zhǎng)依然旺盛，活菌數(shù)也高。說(shuō)明該菌株在低pH值下也能生長(zhǎng)良好。

2.1.3 最佳接種量 在獲得最佳初始pH值和培養(yǎng)溫度后，對(duì)菌株分別采用5個(gè)接種量（2%、4%、6%、8%、10%），180 r/min，培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌數(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖3，一定范圍內(nèi)，菌株發(fā)酵的菌數(shù)隨著接種量的增加而增加，當(dāng)接種量超過(guò)6%時(shí)，活菌數(shù)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。在接種量為2%和4%時(shí)，活菌數(shù)分別為5.93×108 CFU/mL和6.11×108 CFU/mL，相差不大。從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，可選擇2%的接種量。

2.1.4 最佳裝液量 裝液量對(duì)酵母菌體數(shù)的影響實(shí)際上反映的是溶解氧對(duì)酵母菌體數(shù)的影響。裝液量對(duì)酵母JM-1菌體數(shù)的影響見(jiàn)圖4，由圖可知，菌液裝量為100 mL時(shí)，菌體數(shù)達(dá)6.05×108 CFU/mL。當(dāng)在容量為500 mL的三角瓶中裝入50～250 mL培養(yǎng)液時(shí)，菌體均能很好的生長(zhǎng)。但隨著裝液量增多，活菌數(shù)略有下降。由此可見(jiàn)，裝液量雖然對(duì)菌體的生長(zhǎng)有影響，但影響不大，這也在一定程度上說(shuō)明該菌在有氧和缺氧條件下都能生長(zhǎng)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮各發(fā)酵條件對(duì)酵母JM-1脫氨性能影響，為了得出初步優(yōu)化的發(fā)酵條件，以活菌數(shù)為指標(biāo)，設(shè)置L9（34）正交表進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，共9個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2的試驗(yàn)結(jié)果可知，菌株JM-1發(fā)酵條件的最佳組合為A2B2C2D2（最優(yōu)組合未在正交試驗(yàn)組合中），即培養(yǎng)溫度30℃，初始pH值 5.0，500 mL三角瓶裝液量150 mL，接種量4%，培養(yǎng)24 h，酵母的發(fā)酵菌數(shù)超過(guò)7.42×108 CFU/mL。根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表2的極差分析和表3的方差分析可知，所考察的各個(gè)因子中初始pH值和接種量對(duì)活菌數(shù)的影響相當(dāng)大，均達(dá)到極顯著水平。其中，影響酵母JM-1活菌數(shù)的主次因素依次為：接種量>裝液量>初始pH值>培養(yǎng)溫度，即D因素（接種量）為影響酵母菌體數(shù)的最主要因素，其次是C因素（裝液量）和B因素（初始pH值），而A因素（培養(yǎng)溫度）的影響最小。

3 結(jié)論與討論

畜禽養(yǎng)殖已成為農(nóng)村經(jīng)濟(jì)新的增長(zhǎng)點(diǎn)和重要的支柱產(chǎn)業(yè)。隨著各地規(guī)?；男笄蒺B(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖業(yè)的環(huán)境污染總量、污染程度也發(fā)生了極大變化。畜禽養(yǎng)殖業(yè)所產(chǎn)生的惡臭污染已成為不可忽視的重大污染源。

在沒(méi)有人工干預(yù)的情況下，對(duì)環(huán)境中污染物進(jìn)行降解主要是依賴環(huán)境中本身存在的土著微生物進(jìn)行自然凈化，但微生物生長(zhǎng)緩慢導(dǎo)致降解速度慢。因此，直接接種培養(yǎng)馴化后的菌種可加速污染物的降解[6-8]。

該文將前期獲得的養(yǎng)殖場(chǎng)除臭酵母菌JM-1的發(fā)酵溫度、初始pH值、裝液量和接種量進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。單因素試驗(yàn)研究表明，酵母菌JM-1在培養(yǎng)溫度25～35℃，初始pH值在4.0～6.0內(nèi)均能很好的生長(zhǎng)。對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行正交試驗(yàn)，獲得最佳發(fā)酵工藝條件為：培養(yǎng)溫度 30℃，初始pH值5.0，500 mL錐形瓶裝液量150 mL，接種量4%。在此條件下培養(yǎng)24 h，酵母菌的發(fā)酵菌數(shù)超過(guò)7.42×108 CFU/mL。與優(yōu)化前的6.11×108 CFU/mL相比較，活菌數(shù)提高了21.1%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊 柳，邱艷君. 除臭菌株對(duì)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)惡臭氣體的控制研究[J]. 中國(guó)沼氣，2014，32（3）：36-39.

[2] 韓昆鵬，楊 凌，卞紅春，等. 微生物除臭技術(shù)在畜禽養(yǎng)殖臭氣治理中的研究應(yīng)用進(jìn)展[J].山東畜牧獸醫(yī)，2019，40（7）：74-77.

[3] 鄧素芳，楊有泉，陳 敏. 畜禽養(yǎng)殖舍臭氣控制研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)畜牧雜志，2010，46（22）：48-51.

[4] 皮勁松，張 昊，萬(wàn)緒波. 蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)臭氣產(chǎn)生與治理[J]. 養(yǎng)殖與飼料，2019（1）：8-10.

[5] 申彥晶，饒力群，任 杰. 降氨除臭芽孢桿菌的篩選鑒定及其氮素遷移過(guò)程[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2015，42（7）：1234-1240.

[6] Shankar S，Kansrajh C，Dinesh M G，et al. Application of indigenous microbial consortia in bioremediation of oil-contaminated soils[J]. International Journal of Environmental Science and Technology，2014，11（2）：367-376.

[7] 白 瑞，胡 陽(yáng)，雷振宇，等. 復(fù)合微生物制劑在環(huán)保領(lǐng)域中的應(yīng)用[J]. 應(yīng)用化工，2017，46（5）：1002-1006.

[8] 李曉樓. 石油污染土壤的土著微生物修復(fù)影響因素研究[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)（自科版），2014，11（22）：25-27.

（責(zé)任編輯：唐珊珊）