張文文，任英，張榮超，郝貴周

(魯南貝特制藥有限公司，中藥制劑新技術(shù)研究中心，山東 臨沂 271600)

金銀花為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花。具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱之功效，臨床應(yīng)用廣泛，年需求量一般在萬噸以上。化學(xué)成分多樣[1-6]，藥理作用廣泛[7]；現(xiàn)已從金銀花中分離出的化合物有145種，主要為有機(jī)酸類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類化合物等[8]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明,金銀花藥理作用主要表現(xiàn)在抑菌、抗病毒、解熱、抗炎、保肝、止血、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等方面。忍冬葉作為新藥源，年產(chǎn)量一般在數(shù)十萬噸以上。與金銀花相比，化學(xué)成分相似、臨床功效基本相同。李時珍《本草綱目》曾記載“莖葉及花，功用皆同”，并且忍冬葉不受花期限制，四季均可采收。但各產(chǎn)區(qū)忍冬葉仍作為非藥用部位被丟棄，造成了極大的資源浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失。目前，國內(nèi)外對忍冬葉進(jìn)行了一定相關(guān)研究，但與金銀花相比，其研究還不夠深入，未能充分挖掘其藥理功效及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，本文在傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾基礎(chǔ)上，采用水-有機(jī)溶劑多級蒸餾提取金銀花及忍冬葉揮發(fā)油，進(jìn)行成分對比分析，同時進(jìn)行揮發(fā)油提取物的增強(qiáng)免疫作用研究，探討金銀花和忍冬葉揮發(fā)油對增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞增殖效果的影響。

1 儀器和試藥

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 6890/5973型)和 GC-MSD數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(NIST 05質(zhì)譜庫，WILEY 275質(zhì)譜庫，美國Agilent公司)；U-3000紫外-可見分光光度計(上海譜元儀器有限公司)；生物倒置顯微鏡(Olympus CKX41)，電子天平(JA2003)，酶標(biāo)儀(Multiskan MK3)；二氧化碳培養(yǎng)箱(311，Thermo公司)，超凈工作臺(DL-CJ-1N)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50KBS)；24孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司)；胎牛血清(無噬菌體，低內(nèi)毒素，杭州四季青)；PBS(凱基生物)；胰蛋白酶(凱基生物，不含Hank′s液，不含酚紅)；DMEM高糖培養(yǎng)基(凱基生物，含雙抗)；噻唑藍(lán)(MTT，凱基生物)；Hank′s液(Solarbio公司)；PBS緩沖液(Hyclone公司)；刀豆蛋白A(ConA，Sigma公司)；2-巰基乙醇、鹽酸、異丙醇、95% 乙醇、乙酸乙酯等均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

C57雄性小鼠，5～6周鼠齡，體重(20±2)g；購于濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)20140007。

金銀花、忍冬葉均采自山東平邑鄭城金銀花GMP基地，經(jīng)臨沂大學(xué)辛杰老師鑒定分別為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的花和葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油樣品制備 分別稱取金銀花及忍冬葉粗粉(40目)各300 g，料液比10∶1，浸泡2 h[9-13]，采用多級蒸餾裝置(自制)，水-乙酸乙酯蒸餾，防止揮發(fā)油凝結(jié)在冷凝管，連續(xù)蒸餾12 h；得黃色乙酸乙酯液體，揮干有機(jī)溶劑。0.45 μm微孔濾膜過濾，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)色譜條件 氣相色譜柱：HP-5MS石英彈性毛細(xì)管柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫，初始柱溫60 ℃，以5 ℃·min-1升至260 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度為260 ℃；載氣：高純氮，流速1 mL·min-1；分流進(jìn)樣，分流比10∶1，溶劑延遲4 min，進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜離子源:電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃；掃描范圍：40.00～500.00 amu；

2.3 淋巴細(xì)胞增殖試驗 小鼠室溫20～26 ℃，日溫差≤4 ℃，相對濕度40%～70%，明暗交替時間為12/12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分為10組，每組10只，按小鼠體重給藥量不同，分為空白組、金銀花和忍冬葉揮發(fā)油提取物(1 mg·kg-1)、金銀花和忍冬葉揮發(fā)油提取物(2 mg·kg-1)、金銀花和忍冬葉揮發(fā)油提取物(4 mg·kg-1)和陽性対照組(銀耳孢糖膠囊)，0.1 mL·(10 g)-1，連續(xù)灌胃30 d后，測定免疫指標(biāo)。小鼠末次給藥后，脫頸椎處死，無菌取小鼠的脾臟置盛有Hank′s液的培養(yǎng)皿中，用注射器活塞研磨，使單個細(xì)胞游離出來，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank′ s液洗3次，每次離心10 min(1 000 rpm)。然后將細(xì)胞懸浮于2 mL DMEM完全培養(yǎng)液中，生物倒置顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL。將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，一孔加入75 μL ConA液，另一孔作為對照，置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔吸取上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，同時加入MTT(5 mg·mL-1)50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打均勻使紫色結(jié)晶完全溶解，然后集中到96孔培養(yǎng)板中，在酶標(biāo)儀上測定OD值，計算加ConA孔吸光度與不加ConA孔吸光度的差值。

2.4 分析方法 統(tǒng)計分析用SPSS 16.0軟件。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 金銀花、忍冬葉揮發(fā)油提取率、成分及含量分析 采用自制多級蒸餾提取設(shè)備，金銀花、忍冬葉揮發(fā)油提取率分別為0.69%、0.42%。經(jīng)過GC-MS分析，得到揮發(fā)油總離子流色譜圖(見圖1～2)；采用NIST 05、WILEY 275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫對采集到的質(zhì)譜圖進(jìn)行對比；通過文獻(xiàn)檢索、質(zhì)譜分析進(jìn)行化合物鑒定；通過色譜峰面積歸一化法對化合物進(jìn)行定量分析。最終得到金銀花和忍冬葉揮發(fā)油成分及含量結(jié)果(見表1)。

分析表1可知，金銀花及忍冬葉揮發(fā)油種類豐富，主要包括烷烴、烯烴、炔烴、醚、酯、脂肪酸、醇、醛、酮等，分別占到總揮發(fā)油含量的94.69%、95.02%。其次，各成分在金銀花和忍冬葉揮發(fā)油中所占比例也不同，脂肪酸類分別占59.6%、60.48%，與其他文獻(xiàn)相比[8-12]，采用自制多級蒸餾設(shè)備，脂肪酸類提取率明顯升高；醇類分別占8.82%、9.14%；烷烴分別占5.17%、0.84%；酯類分別占8.17%、9.46%；烯烴分別占1.86%、2.7%；酮類分別占1.11%、1.24%；醛類分別占1.06%、2.37%；其他成分所占比例較小。各單體成分含量比較，金銀花和忍冬葉中均以棕櫚酸含量最高，分別占38.52%、43.77%；其次是亞油酸、芳樟醇、亞麻酸甲酯、月桂酸、硬脂酸、鄰苯二甲酸二丁酯等；這說明金銀花、忍冬葉揮發(fā)油在成分和含量上均具有較高的相似性。但同時，忍冬葉揮發(fā)油中14-甲基十五酸甲酯、香葉醇的含量較高，而金銀花揮發(fā)油中烷烴類種類較多、含量較高，這說明兩者之間也存在一定的差異性。

圖1 金銀花揮發(fā)油 GS-MS 總離子流

圖2 忍冬葉揮發(fā)油 GS-MS 總離子流

2.6 揮發(fā)油成分對小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響 藥理實驗結(jié)果見表2、圖3。與空白組比較，在體外培養(yǎng)條件下，金銀花和忍冬葉揮發(fā)油在一定濃度范圍內(nèi)對小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化均具有明顯的促進(jìn)作用，并呈現(xiàn)劑量與藥效顯著性正相關(guān)，即隨藥物濃度的升高，其藥理作用不斷增強(qiáng)。在藥物劑量為1、2 mg·kg-1時，金銀花揮發(fā)油和忍冬葉揮發(fā)油藥理活性基本相同；在藥物劑量為4 mg·kg-1時，忍冬葉揮發(fā)油活性顯著增強(qiáng)。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》的有關(guān)規(guī)定，金銀花及忍冬葉3個劑量組結(jié)果為陽性，因此，判定揮發(fā)油成分具有細(xì)胞免疫功能。通過分析，發(fā)現(xiàn)忍冬葉揮發(fā)油的促淋巴細(xì)胞增殖活性均高于金銀花揮發(fā)油，這為進(jìn)一步開發(fā)忍冬葉這一新藥源提供了一定的科研思路。

表1 金銀花、忍冬葉揮發(fā)油成分及含量

表2 淋巴細(xì)胞增殖測定結(jié)果(n=10)

圖3 揮發(fā)油成分對小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響效果

3 討論

結(jié)合大生產(chǎn)中金銀花揮發(fā)油易于凝結(jié)在冷凝管壁的現(xiàn)象，在傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾基礎(chǔ)上，通過實驗設(shè)備改進(jìn)，采用水-有機(jī)溶劑多級蒸餾提取的方式，大大提高了金銀花及忍冬葉揮發(fā)油提取率。通過GC-MS分析發(fā)現(xiàn)，金銀花與忍冬葉揮發(fā)油在種類及含量上存在一定相似性，均主要包含烷烴、烯烴、炔烴、醚、酯、脂肪酸、醇、醛、酮等成分；且均以脂肪酸類成分含量最高。同時，兩者也存在一定差異，忍冬葉揮發(fā)油中烷烴種類和含量相對較少。

金銀花揮發(fā)油藥理作用廣泛，本研究采用脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗，對比了金銀花和忍冬葉揮發(fā)油對免疫功能的藥效作用。結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)。金銀花和忍冬葉揮發(fā)油成分均表現(xiàn)出明顯的免疫增強(qiáng)作用，且忍冬葉的免疫活性作用相對更強(qiáng)。上述研究為忍冬葉新藥源及保健開發(fā)提供了一定理論基礎(chǔ)，但仍需進(jìn)一步明確其藥理機(jī)制。