郭 欣，郭 萌

(1. 漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院,福建漳州 363000;2. 農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心,福建漳州 363000)

黑木耳(Auriculariaauricular)又稱(chēng)木耳，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分及生理功能物質(zhì)[1]，具有較高的食用和藥用價(jià)值。其中，存在于細(xì)胞中的黑木耳多糖是黑木耳生物活性的主要成分，具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂和增強(qiáng)免疫等功效[2-4]。近年來(lái)，黑木耳功能性保健食品開(kāi)發(fā)研究逐漸增多，例如黑木耳發(fā)酵飲料、黑木耳面包、黑木耳果凍、黑木耳低脂灌腸制品等[5-6],但這些產(chǎn)品大多未對(duì)黑木耳進(jìn)行深加工，僅是將其作為原料直接添加入食品中，黑木耳多糖溶出率不高，造成了原料的浪費(fèi)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于提高多糖提取率的方法研究主要集中在熱水浸提法[7]、酸堿浸提法[8-9]及酶、微波、超聲等輔助提取法[10-12]。這些提取方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、工藝復(fù)雜、加入化學(xué)溶劑、破壞其它營(yíng)養(yǎng)成分等不足，不適合后續(xù)食品加工。

本文采用酵母發(fā)酵法，利用酵母菌內(nèi)在酶系，促使黑木耳細(xì)胞壁纖維之間的酯鍵斷裂而發(fā)生剝皮反應(yīng)[13-14]，使更多易被人體吸收的黑木耳多糖游離釋放出來(lái)。此方法成本低、易操作，黑木耳多糖溶出率高，并且原有營(yíng)養(yǎng)成分基本保持不變，是一種相對(duì)有效，更加適合保健食品深加工的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

黑木耳：福建省龍海市安利達(dá)工貿(mào)有限公司；酵母：湖北安琪酵母有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋(JHH-4)：江蘇榮華儀器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV5800PC)：北京普析通用儀器有限公司；pH計(jì)：上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵工藝流程

發(fā)酵工藝流程如圖1所示。

圖1發(fā)酵工藝流程圖
Fig1Fermentation process flow cohart

1.3.2 黑木耳多糖提取及測(cè)定

參照王偉等[15]的提取方法。發(fā)酵液離心過(guò)濾取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。隨后緩慢加入3倍體積的無(wú)水乙醇，低溫靜置過(guò)夜可見(jiàn)沉淀，即為黑木耳粗多糖。多糖含量測(cè)定方法參照苯酚-硫酸法測(cè)定[16]。多糖提取率(%)=多糖質(zhì)量(g)/干木耳質(zhì)量(g)×100 %

1.3.3 酵母發(fā)酵法提高黑木耳多糖溶出率單因素試驗(yàn)

(1)不同酵母添加量對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響

在發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間16 h，pH 6.5的條件下，選取酵母添加量為 0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 g/L等5個(gè)水平，研究不同酵母添加量對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響。

(2)不同發(fā)酵溫度對(duì)黑木耳多糖溶出率影響

在酵母添加量0.75 g/L，發(fā)酵時(shí)間16 h，pH6.5的條件下，選取發(fā)酵溫度為18、22、26、30、34、38 ℃等6個(gè)水平，研究不同發(fā)酵溫度對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響。

(3)不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑木耳多糖溶出率影響

在酵母添加量0.75 g/L，發(fā)酵溫度30 ℃，pH6.5的條件下，選取發(fā)酵時(shí)間為8、16、24、32、40 h等5個(gè)水平，研究不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響。

(4)不同pH對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響

在酵母添加量0.75 g/L，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間16 h的條件下，選取pH為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5等5個(gè)水平，研究不同pH對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以酵母添加量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)和pH值(D)作為自變量，以黑木耳多糖溶出率為指標(biāo)，優(yōu)化酵母發(fā)酵法提高黑木耳多糖溶出率的工藝條件。因素及水平如表1所示。

表1響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平
Table1Factors and levels of responsesurface design

水平因素A:酵母添加量/(g·L-1)B:發(fā)酵溫度/℃C:發(fā)酵時(shí)間/hD:pH-10.52685.500.7530166.51134247.5

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同酵母添加量對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響

由圖2可以看出，黑木耳多糖溶出率隨著酵母添加量的增加先呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，發(fā)酵進(jìn)程縮短；當(dāng)酵母添加量達(dá)到0.75 g/L時(shí)，黑木耳多糖溶出率最高；之后隨酵母添加量繼續(xù)增大，溶出率反而下降，這可能是因?yàn)樵诠潭ǖ臓I(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，過(guò)多的酵母數(shù)量使得酵母之間出現(xiàn)互相爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)的現(xiàn)象，從而影響酵母的活性。因此，最佳酵母添加量選擇為0.75 g/L。

圖2 不同酵母添加量對(duì)黑木耳多糖 溶出率的影響Fig 2 Effects of different yeast addition on dissolution rate of polysaccharide from Auricularia auricular

2.1.2 不同發(fā)酵溫度對(duì)黑木耳多糖溶出率影響

由圖3可見(jiàn)，隨著發(fā)酵溫度的增加，黑木耳多糖溶出率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在30 ℃時(shí)出現(xiàn)峰值。因?yàn)榻湍傅淖钸m生長(zhǎng)溫度為30 ℃，在此溫度下，酵母生長(zhǎng)最旺盛，體內(nèi)酶系活性大大增加，催化黑木耳細(xì)胞壁纖維不斷裂解，使多糖更容易游離出來(lái)[17-18]。而低溫和高溫都不利于酵母的生長(zhǎng)，因此，最佳發(fā)酵溫度選擇為30 ℃。

圖3 不同發(fā)酵溫度對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響Fig 3 Effects of different fermntation temperature on dissolution rate of polysaccharide from Auricularia auricular

2.1.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑木耳多糖溶出率影響

由圖4可見(jiàn)，發(fā)酵初期，黑木耳多糖溶出率有所增加，在發(fā)酵16 h時(shí)達(dá)到最高值17.52%。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，黑木耳多糖溶出率不斷下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間改變了溶出的多糖結(jié)構(gòu)[19]，同時(shí)酵母發(fā)酵產(chǎn)生的CO2導(dǎo)致發(fā)酵液酸度降低，從而抑制酵母菌活性。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間選擇為16 h。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響Fig 4 Effects of different fermntation time on dissolution rate of polysaccharide from Auricularia auricular

2.1.4 不同pH對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響

由圖5可知，發(fā)酵液pH在4.5～6.5時(shí)，黑木耳多糖溶出率逐漸上升，說(shuō)明弱酸性條件有利于黑木耳多糖的溶出。當(dāng)pH超過(guò)6.5時(shí)，黑木耳多糖溶出率出現(xiàn)快速下降的現(xiàn)象，說(shuō)明堿性環(huán)境時(shí)會(huì)破壞黑木耳多糖的結(jié)構(gòu)使其降解，進(jìn)而影響黑木耳多糖的溶出率。因此，最佳pH選擇為6.5。

圖5 不同pH對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響Fig 5 Effects of different pH on dissolution rate of polysaccharide from Auricularia auricular

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以酵母添加量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)和pH(D)作為自變量，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。利用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行回歸分析。

表2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果
Table2The results of response surface experiments

序號(hào)ABCD溶出率/%10000 17.6621001 16.89 300-11 14.6240000 17.1650-101 14.7560101 16.577-1100 14.88810-10 15.239-10-10 13.46 101100 15.9611-100-1 13.5712-1-100 13.8613-1010 14.88141010 16.5715-1001 16.39160000 17.2517010-1 14.571800-1-1 11.67190000 16.9820001-1 15.8821100-1 15.49220110 16.052301-10 14.08241-100 16.72250011 16.37260-1-10 12.24270-10-1 13.52280-110 14.3290000 17.06

對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸模擬分析，得到以黑木耳多糖溶出率(Y)為響應(yīng)值的回歸方程：Y=17.194+0.818 3A+0.56B+1.062 5C+0.907 5D-0.445AB-0.02AC-0.355AD-0.022 5BC+0.192 5BD-0.615CD-0.547 8A2-1.347 8B2-1.616 5C2-0.999D2。

表3方差分析表
Table3The variance analysis

方差來(lái)源平方和自由度均方F值P值顯著性Model64.366 144.59718.37<0.000 1??A3.763 13.763 215.0430.017?B9.882 19.88239.502<0.000 1??C13.54 113.5454.15<0.000 1??D8.036 18.03632.12<0.000 1??AB0.792 1 10.792 13.1660.096 9AC1.600×10-3 11.600×10-36.396×10-30.937 4AD0.504 1 10.504 12.0150.177 6BC2.025×10-3 12.025×10-38.095×10-30.929 6BD0.148 22 10.148 20.5920.454 2CD1.512 9 11.512 96.0470.027 5?A21.947 11.946 77.7820.014 5?B211.783 111.78347.106<0.000 1??C216.951 116.95167.76<0.000 1??D26.474 16.47425.880.000 2??殘差3.502 140.250 1失擬項(xiàng)3.327 100.332 77.636 0140.052 5凈誤差0.174 40.043 5總和67.86 28

注：**為差異極顯著(P<0.01);*為差異顯著(P<0.05)

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

由表3顯著性分析可知，酵母添加量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)和pH(D)4個(gè)因素之間不是簡(jiǎn)單線(xiàn)性關(guān)系，而是相互交叉作用。依據(jù)上述回歸方程，繪制4個(gè)因素交互作用下的響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖，如圖6所示。

圖6 各因素交互作用對(duì)黑木耳多糖溶出率的響應(yīng)面和等高圖Fig 6 Response surface and contour map of the interaction of various factors on the dissolution rate of Auricularia auricular polysaccharide

由圖6a可知，沿著B(niǎo)因素(發(fā)酵溫度)移動(dòng)的等高線(xiàn)密度高于A因素(酵母添加量)方向。從曲面3D圖也可以看出，沿著B(niǎo)因素方向的曲面更陡峭。這說(shuō)明發(fā)酵溫度對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響大于酵母添加量。由圖6b可知，沿著C因素(發(fā)酵時(shí)間)移動(dòng)的等高線(xiàn)密度高于A因素(酵母添加量)方向。從曲面3D圖也可以看出，C因素方向響應(yīng)面曲線(xiàn)有一定的坡度。這說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響大于酵母添加量。同理，D因素(pH)對(duì)溶出率的影響大于A因素(酵母添加量)，C因素(發(fā)酵時(shí)間)對(duì)溶出率的影響大于B因素(發(fā)酵溫度)。綜合以上分析可知，4個(gè)因素對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響主次順序?yàn)椋喊l(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度>pH>酵母添加量，與表3方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 最優(yōu)條件及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design Expert 8.0.6.1數(shù)據(jù)分析，酵母發(fā)酵法提高黑木耳多糖溶出率的最佳工藝條件為酵母添加量0.753 g/L、發(fā)酵溫度30.72 ℃、發(fā)酵時(shí)間16.8 h、pH6.58，此條件下黑木耳多糖溶出率預(yù)測(cè)值為17.74%?？紤]到實(shí)際加工條件的便利性，最終將最佳工藝選擇為酵母添加量0.75 g/L、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間16 h、pH6.5。用該工藝條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到黑木耳多糖溶出率平均值為17.65%，與預(yù)測(cè)值接近，充分驗(yàn)證了該回歸模型的準(zhǔn)確性和可靠性，可用于酵母發(fā)酵法提高黑木耳多糖溶出率工藝優(yōu)化。

2.3 對(duì)比研究酵母發(fā)酵法與其它提取方法對(duì)黑木耳多糖溶出率的影響

為探討酵母發(fā)酵法的優(yōu)越性，將其與其它學(xué)者研究的不同提取方法進(jìn)行比較。陸雯等[20]采用熱水浸提法，在提取溫度60 ℃、料液比為1∶40、提取時(shí)間為2.5 h的最佳提取條件下測(cè)得黑木耳多糖提取率為5.12%。陳祖琴等[21]通過(guò)超聲波提取法提取木耳多糖，通過(guò)對(duì)粒徑、超聲波功率、時(shí)間及料液比4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn), 測(cè)得黑木耳多糖提取率為11.95%。本試驗(yàn)中，酵母發(fā)酵法測(cè)得黑木耳多糖提取率可達(dá)17.65%，明顯高于熱水浸提法和超聲波提取法，大大提高了原料的利用率，有利于降低食品企業(yè)的生產(chǎn)成本。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用對(duì)黑木耳漿進(jìn)行酵母發(fā)酵的方法，在原有營(yíng)養(yǎng)成分基本保持不變的情況下，提高黑木耳多糖溶出率。利用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)該工藝中的各個(gè)影響因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，建立多元回歸模擬方程。通過(guò)方差及響應(yīng)曲面分析得到影響黑木耳多糖溶出率的因素主次順序?yàn)椋喊l(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度>pH>酵母添加量。通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，得到最佳工藝條件為酵母添加量0.75 g/L、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間16 h、pH6.5。在此條件下，黑木耳多糖溶出率為17.65%，與預(yù)測(cè)值(17.74%)接近，說(shuō)明該回歸模型的準(zhǔn)確性和可靠性，可用于酵母發(fā)酵法提高黑木耳多糖溶出率工藝優(yōu)化。