李鳳中 陳衛(wèi)國 陳小林 (萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江西 萍鄉(xiāng) 337000；肝病科)

乙型肝炎病毒(HBV)感染仍為全世界重要的公共衛(wèi)生問題，目前約超過 2.4 億人是HBV表面抗原(HBsAg)攜帶者。在 HBV 入侵人體并造成感染后，病毒、環(huán)境及宿主因素均可在進(jìn)展為肝硬化、肝代謝異常甚至肝癌的過程中起重要作用〔1〕。近年來，宿主的基因多態(tài)性及免疫應(yīng)答成為探索 HBV 感染后不同結(jié)局的熱點(diǎn)〔2〕。體內(nèi)研究也證明，1，25二羥基維生素D〔1,25(OH)2D〕可增強(qiáng)宿主抵抗病毒的能力〔3〕。將維生素 D 及其類似物與抗病毒治療手段結(jié)合應(yīng)用時(shí)，可顯著提高機(jī)體的免疫應(yīng)答率，從而為抗病毒治療提供新的思路。CYP2R1基因位于染色體11p15.2上，含有5個(gè)外顯子，編碼維生素D25-羥化酶〔4〕。研究表明CYP2R1基因的單核苷酸的多態(tài)性(SNP)與人體內(nèi)25(OH)2D水平顯著相關(guān)，位于該基因第2外顯子上的一個(gè)錯(cuò)義突變可能會引起體內(nèi)維生素D缺乏現(xiàn)象，并最終影響維生素D生物學(xué)效能的發(fā)揮，增加2型糖尿病(T2DM)的患病風(fēng)險(xiǎn)〔5〕。但是有關(guān)CYP2R1 多態(tài)性與HBV感染及對乙型病毒肝炎(CHB)抗病毒治療的關(guān)系研究還未見報(bào)道，因此有關(guān) CYP2R1基因多態(tài)性與抗病毒治療CHB療效作用還需進(jìn)一步研究。本研究選擇CYP2R1基因兩個(gè) SNP位點(diǎn)作為候選位點(diǎn)進(jìn)行基因分型分析，檢測其CYP2R1基因多態(tài)性及抗病毒治療療效進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1病例選擇 選取2016年6月至2017年12月萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院肝病門診及住院的CHB患者65例為研究對象，男38例，女27例，平均年齡(62.1±4.03)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg呈陽性且已持續(xù)6個(gè)月以上；HBV DNA水平>1×105拷貝/ml；乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)陽性；乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)為陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有人免疫缺陷病毒(HIV)和丁型肝炎病毒(HDV)及丙型肝炎病毒(HCV)感染；有肝癌或肝癌病史,甲胎蛋白(AFP)>50 ng/ml;以往接受過核苷酸或核苷酸類藥物治療；既往5年內(nèi)發(fā)生過其他系統(tǒng)腫瘤病史。

1.2治療方法 符合本研究入選標(biāo)準(zhǔn)的患者進(jìn)行抗病毒治療，給予常規(guī)恩替卡韋治療，口服0.5 mg/d(南京正大天晴制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20120038)，治療48 w?；颊吲R床數(shù)據(jù)使用標(biāo)準(zhǔn)案例記錄表格收集。

1.3乙肝病毒學(xué)治療應(yīng)答定義 在連續(xù)給予恩替卡韋治療48 w后，HBV DNA小于500拷貝/ml，持續(xù)維持HBV DNA低水平至隨訪結(jié)束的72 w，同時(shí)患者血清HBeAg由陽性轉(zhuǎn)為陰性，HBeAb為陽性且丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)值正常范圍內(nèi)稱為完全應(yīng)答(CR)，反之沒有發(fā)生血清HBeAg轉(zhuǎn)變，稱為非完全應(yīng)答(NCR)。

1.4研究方法 給予CHB患者恩替卡韋治療后，分別在12、24、48、72 w進(jìn)行病例隨訪，并完成下列指標(biāo)的檢測：臨床生化指標(biāo)：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、ALT、 總膽紅素(TBiL)、總蛋白(TP)及白蛋白(ALB)，使用AU5400生化儀檢測(貝克曼公司)。HBV DNA檢測：HBV DNA指標(biāo)的檢測由醫(yī)院PCR室按常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行，引物及相關(guān)步驟方法均按照中山大學(xué)達(dá)安基因 (PCR-熒光探針法)檢測，嚴(yán)格遵照試劑盒說明書，貨號DA0031。CHB患者CYP2R1 rs2060793，rs12794714 基因分型檢測：人外周血全基因組DNA提取應(yīng)用QIAGEN試劑盒，根據(jù)試劑盒的操作步驟，采用PCR方法來擴(kuò)增目的基因。引物序列和PCR條件見表1。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)。

表1 引物序列及反應(yīng)條件

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床特征比較 65例CHB患者在經(jīng)過恩替卡韋抗病毒治療后，顯示CR為30例(CR組)，NCR為35例(NCR組)。兩組性別、治療前HBV DNA含量、AST及ALT水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

組別n男/女(n)年齡(歲)HBV DNA(log 10拷貝/ml)AST(U/L)ALT(U/L)CR組3018/1262.09±4.126.01±0.5334.59±3.3278.12±8.63NCR組3520/1562.55±2.975.95±0.4836.78±4.5280.74±7.71χ2或t/P值2.684/0.1020.852/0.2030.209/0.7040.642/0.4520.954/0.195

2.2CYP2R1基因SNP位點(diǎn)等位頻率及Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗(yàn) 在對CHB患者進(jìn)行基因分型后，分析CYP2R1各個(gè)位點(diǎn)的等位頻率，CYP2R1 rs2060793(-89T/T)和rs12794714 (-65T/C)次要等位基因頻率分別為36.20%和16.70%，基因型頻率的觀測值和H-W預(yù)期值之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.516,P=0.125;χ2=2.049,P=0.107)，表明本研究中所選群體研究對象有代表性，達(dá)到遺傳平衡定律。

2.3CYP2R1 rs2060793 和rs12794714 SNP位點(diǎn)基因分型與抗病毒治療后HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換關(guān)聯(lián)分析 CR組rs12794714位點(diǎn)T等位基因頻率明顯高于NCR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.07,P=0.035)。與C等位基因相比，T等位基因發(fā)生血清HbeAg轉(zhuǎn)換的比值比OR為2.019(0.982～4.319)。TT和TC合并分析發(fā)現(xiàn)，攜帶TT基因型的患者在經(jīng)過恩替卡韋治療后，更容易實(shí)現(xiàn)血清轉(zhuǎn)換，抗病毒應(yīng)答效果更明顯。而對于CYP2R1 rs 2060793位點(diǎn)，T等位基因頻率在兩組分布與TT基因型在兩組分布頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見表3。

2.4CYP2R1 rs12794714基因型與恩替卡韋治療后CHB患者HBV DNA含量關(guān)聯(lián)分析 攜帶CYP2R1 rs12794714 TT基因型的患者在恩替卡韋在用藥后第12 w、24 w、48 w及72 w隨訪HBV DNA含量低于非TT基因型的患者，其中第24、48、72周兩組差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，見表4。

表3 CYP2R1 SNP位點(diǎn)分型與血清學(xué)HBeAg轉(zhuǎn)換的關(guān)聯(lián)性分析 (n)

基因型n治療前第12周第24周第48周第72周非TT型246.09±0.855.59±0.604.08±0.423.39±0.333.09±0.25TT型415.85±0.785.05±0.463.04±0.302.10±0.272.01±0.18t值1.3251.9852.6043.2683.351P值0.1030.0980.0360.0150.014

3 討 論

HBV入侵機(jī)體后，造成肝臟組織慢性炎癥感染，病毒因素、環(huán)境因素及宿主本身因素均在此過程中起重要作用〔6〕。目前關(guān)于患者維生素D含量減少對許多慢性肝病病情發(fā)生的影響已經(jīng)有報(bào)道〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充維生素D與抗病毒治療手段聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可顯著提高CHB機(jī)體的免疫應(yīng)答率，說明維生素D在抗乙肝病毒治療中有著重要的功能〔8〕。機(jī)體25(OH)D3的含量與其代謝酶的關(guān)系密切，25(OH)D3由維生素D3前體在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)25-羥化作用合成，主要由CYP2R1酶催化〔9〕。研究表明CYP2R1基因的SNP與人體內(nèi)25(OH)D水平顯著相關(guān)，位于該基因第2外顯子上的一個(gè)錯(cuò)義突變可能會引起體內(nèi)維生素D缺乏現(xiàn)象，并最終影響維生素D生物學(xué)效能的發(fā)揮，增加T2DM的患病風(fēng)險(xiǎn)〔10〕。Barooah等〔11〕發(fā)現(xiàn)CYP2R1基因rs10741657位點(diǎn)變異與人體內(nèi)25羥基維生素D3水平顯著相關(guān)，GG基因型攜帶者體內(nèi)25羥基維生素D3水平是AA基因型攜帶者的1/2〔3〕。

CHB患者在臨床治療中要獲得較好的療效，一般要經(jīng)歷3個(gè)過程：HBV DNA的病毒載量水平較低；HBeAg發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換；實(shí)現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)換〔12〕。CR患者血清學(xué)轉(zhuǎn)換成功說明宿主的主動免疫功能恢復(fù)。本研究結(jié)果說明CYP2R1基因多態(tài)性在恩替卡韋治療后病毒學(xué)應(yīng)答有相關(guān)聯(lián)，TT型可以預(yù)測CHB患者在使用恩替卡韋的治療效果。一些研究已提出通過檢測宿主維生素D相關(guān)基因來預(yù)測對恩替卡韋治療的反應(yīng)〔13〕。最近研究表明CHB患者低血清維生素D水平與高水平的HBV復(fù)制和不良臨床結(jié)果相關(guān)，包括肝硬化并發(fā)癥及肝癌〔14〕。CYP2R1 rs12794714 TT基因型可預(yù)測恩替卡韋治療后持續(xù)的HBeAg血清轉(zhuǎn)換。本文結(jié)果與Zhang等〔15〕研究結(jié)論一致，該研究發(fā)現(xiàn)CYP2R1的rs12794714 SNP與中國東北地區(qū)兒童的血清25(OH)D3顯著相關(guān)。

總之，CYP2R1 rs12794714基因多態(tài)性與CHB患者的HBV復(fù)制有關(guān)，可預(yù)測HBeAg陽性CHB患者對恩替卡韋治療的抗病毒應(yīng)答效果。但是本研究有局限性，如沒有評估基線血清25(OH)D3水平的影響，因?yàn)樗艿綆讉€(gè)潛在的混雜變量影響，包括暴露于紫外線陽光，吸收不良，維生素的膳食攝入減少等原因。