洪影雯　梁子寧　廖桂秀　韋麗翠　龍琪云

摘要：采用高效液相色譜法建立穿根藤（Psychotria serpens L.）車葉草苷含量測(cè)定的方法，以車葉草苷含量為指標(biāo)，在甲醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，車葉草苷的最佳提取工藝為70%甲醇溶液、料液比1∶60，提取時(shí)間30 min。

關(guān)鍵詞：穿根藤（Psychotria serpens L.）;車葉草苷;提取工藝

中圖分類號(hào)：TQ461? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）02-0141-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.031? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Extraction technology of anti-inflammatory constituent

asperuloside from Psychotria serpens L.

HONG Ying-wen，LIANG Zi-ning，LIAO Gui-xiu，WEI Li-cui，LONG Qi-yun

（Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China）

Abstract： HPLC was used to establish methods of content determi-nation of asperuloside in Psychotria serpens L.. Asperuloside as index components，on the basis of methanol concentration，liquid ratio and extraction time，we carried out experiments of single factor and orthogonal design to further optimize the extraction process. Optimum extraction of Glycyrrhizic flavonoids：70% methanol，solid-liquid ratio 1∶60，extraction time 30 min.

Key words： Psychotria serpens L.; asperuloside; extraction process

蔓九節(jié)（Psychotria serpens L.）又名穿根藤，為茜草科九節(jié)屬植物[1]。性平，味苦、辛，歸肝經(jīng)，具有祛風(fēng)濕，舒經(jīng)活絡(luò)，消腫止痛等功效，主要治療風(fēng)濕痹痛，腰肌勞損，坐骨神經(jīng)痛，多發(fā)性癰腫，骨結(jié)核，跌打損傷，骨折，咽喉腫痛等癥，是廣西壯族民間常用草藥[1-3]，常用全株治療頭痛、小兒疳積。車葉草苷是穿根藤中主要的活性成分，是一種環(huán)烯醚萜苷類化合物[4]，分子式為C18H22O11。車葉草苷具有抗菌、抗氧化、抗誘變、抗腫瘤和抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[5，6]。藥理研究表明，車葉草苷具體內(nèi)外抗炎作用，其抗炎作用可能是通過抑制NF-кB的活化基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)，減少NO釋放有關(guān);并且車葉草苷在小鼠急性肺損傷病變的治療中具有顯著作用[7，8]。車葉草苷發(fā)揮抗炎作用的同時(shí)還伴隨著鎮(zhèn)痛作用[9]。

本研究通過3種提取工藝（冷浸提取法、超聲提取法、回流提取法）的比較，以車葉草苷為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)等對(duì)車葉草苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，為車葉草苷的開發(fā)和利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗(yàn)材料? 穿根藤藥材分別采于廣西壯族自治區(qū)不同產(chǎn)地，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室梁子寧教授鑒定其為茜草科植物蔓九節(jié)Psychotria serpens L.的全株。

1.1.2? 儀器與試劑? 1260系列高效液相色譜儀（包括G-1311C高壓四元泵，二極管陣列檢測(cè)器，1260series色譜工作站，美國(guó)安捷倫科技公司）。車葉草苷對(duì)照品（上海士鋒生物科技有限公司，批號(hào)18032716）。

1.2? 方法

1.2.1? 對(duì)照品的制備? 精密稱取車葉草苷對(duì)照品適量，加入甲醇溶液制成1 mL含0.623 mg的溶液，取上清液即得。

1.2.2? 供試品的制備? 取穿根藤粉末0.5 g，加70%甲醇溶液30 mL，超聲提取30 min，濾過蒸干，甲醇溶液溶解定容至10 mL容量瓶中，13 000 r/min離心10 min，取上清液，作為供試液。

1.2.3? 車葉草苷含量測(cè)定方法的建立

1）色譜條件。Agilent5TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸（14∶86）為流動(dòng)相，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，柱溫25 ℃，流速0.8 mL/min。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密吸取上述車葉草苷對(duì)照品溶液（0.623 g/L）1 mL，分別置于1、5、10、25、50、100 mL容量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，配制系列車葉草苷對(duì)照品溶液。分別吸取上述6個(gè)濃度的溶液10 μL，按選定的色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積（x）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=11 581.805 8x-59.339 292（r=0.999 73），線性范圍0.006 23～0.623 g/L。

1.2.4? 精密度試驗(yàn)? 取同一車葉草苷對(duì)照品溶液（0.124 6 g/L），連續(xù)進(jìn)樣6次，車葉草苷峰面積的RSD為0.99%，表明儀器精密度良好。

1.2.5? 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 取穿根藤供試品溶液（CGT-1），于0、2、4、6、8、16、24 h分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定，車葉草苷峰面積RSD為1.49%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

1.2.6? 重復(fù)性試驗(yàn)? 稱取穿根藤藥材干燥粉末（CGT-1）0.5 g，共6份，精密稱定，測(cè)定并計(jì)算車葉草苷的含量，RSD為1.53%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.2.7? 加樣回收率試驗(yàn)? 精密稱定已準(zhǔn)確進(jìn)行含量測(cè)定的穿根藤藥材干燥粉末（CGT-1）0.25 g，共6份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入車葉草苷對(duì)照品溶液（0.623 g/L）1.0 mL，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件測(cè)定，計(jì)算得平均加樣回收率為100.72%，RSD為1.92%。

1.2.8? 車葉草苷的提取工藝單因素試驗(yàn)

1）提取方法對(duì)車葉草苷提取率的影響。精密稱取0.5 g穿根藤粉末3份，采用超聲提取法、回流提取法、冷浸提取法對(duì)車葉草苷提取率進(jìn)行工藝考察。

2）甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)車葉草苷提取率的影響。精密稱取0.5 g穿根藤干燥粉末4份，分別以30%、50%、70%、100%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甲醇作為提取溶劑，超聲提取1 h，過濾，蒸干，甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算車葉草苷的含量。

3）提取時(shí)間對(duì)車葉草苷提取率的影響。精密稱取0.5 g穿根藤粉末4份，在料液比為1∶50（g∶mL，下同），甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的條件下分析提取時(shí)間分別為30、60、90、120 min時(shí)車葉草苷的提取率。

4）料液比對(duì)車葉草苷提取率的影響。精密稱取0.5 g穿根藤粉末3份，以甲醇溶液為提取溶劑，提取時(shí)間為1 h的情況下，考察料液比對(duì)車葉草苷提取率的影響，料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶100。

1.2.9? 正交試驗(yàn)? 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交試驗(yàn)表對(duì)甲醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化車葉草苷的最佳提取工藝，因素與水平如表1所示。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 車葉草苷的提取工藝單因素試驗(yàn)

2.1.1? 提取方法對(duì)車葉草苷提取的影響? 精密稱取0.5 g穿根藤粉末3份，采用超聲提取法、回流提取法、冷浸提取法對(duì)車葉草苷提取率進(jìn)行工藝考察，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，冷浸和回流提取法的提取率比超聲提取率大，但超聲提取法成本較低、簡(jiǎn)便易行，綜合考慮后選擇超聲提取法作為車葉草苷提取方法。

2.1.2? 甲醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)車葉草苷提取的影響? 精密稱取0.5 g穿根藤干燥粉末4份，分別以30%、50%、70%、100%的甲醇溶液作為提取溶劑，超聲提取1 h。結(jié)果（圖2）表明，隨著甲醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，車葉草苷提取含量呈上升趨勢(shì)。

2.1.3? 提取時(shí)間對(duì)車葉草苷提取的影響? 精密稱取0.5 g穿根藤粉末4份，在料液比為1∶50，甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的條件下分析提取時(shí)間分別為30、60、90、120 min時(shí)車葉草苷的提取含量。結(jié)果（圖3）表明，當(dāng)提取時(shí)間在30～90 min時(shí)，車葉草苷的提取含量隨時(shí)間的增加而增加，當(dāng)時(shí)間為90 min時(shí)提取含量最大，但當(dāng)提取時(shí)間超過90 min后，隨著時(shí)間的增加，提取含量逐漸下降。

2.1.4? 料液比對(duì)車葉草苷提取的影響? 精密稱取0.5 g穿根藤粉末3份，以甲醇為提取溶劑，提取時(shí)間為1 h的情況下，考察料液比對(duì)車葉草苷提取含量的影響。料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶100。結(jié)果（圖4）表明，料液比從1∶30至1∶60呈上升趨勢(shì)，在1∶60達(dá)到最高，然后隨著提取液增加提取含量減小。

2.2? 車葉草苷的提取工藝正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)甲醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化車葉草苷的最佳提取工藝，試驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析見表2和表3。

以車葉草苷含量為指標(biāo)，則影響程度依次為A>B>C。A、B因素對(duì)提取率有顯著影響，C因素?zé)o顯著影響。方差分析顯示R1>R2>R3。結(jié)果表明，提取溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為最主要因素，料液比次之，提取時(shí)間的影響最小，最佳提取條件為A2B3C3，即甲醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶60、提取時(shí)間90 min。

2.3? 車葉草苷提取的工藝驗(yàn)證

為進(jìn)一步確定最佳提取條件，對(duì)正交試驗(yàn)分析得到的車葉草苷提取最佳的條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果見表4。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩個(gè)不同提取條件下A2B3C3提取方法的車葉草苷含量稍大于A2B3C1，但總體差異不大，從節(jié)省時(shí)間、降低成本的角度考慮，綜合比較后確定最佳提取工藝為70%甲醇溶液、料液比1∶60、提取時(shí)間30 min。

3? 討論

穿根藤中主要成分有環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類和三萜類成分，其中環(huán)烯醚萜苷類主要有車葉草苷。研究表明環(huán)烯醚萜苷類成分具有抗腫瘤和抗病毒、抗抑郁、抗炎鎮(zhèn)痛、抗阿爾海默病、抗休克、抗肥胖以及保護(hù)心血管等作用[10]。車葉草苷具有抗菌、抗氧化、抗誘變、抗腫瘤和抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[11，12]。穿根藤具有的舒經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)止痛等功效與車葉草苷的抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化和抗癌等作用相關(guān)。因此，本研究以車葉草苷含量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。車葉草苷作為穿根藤抗炎有效成分的作用機(jī)制則有待另文報(bào)道。

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收稿日期：2019-02-11

基金項(xiàng)目：廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（桂科基字[2014]32號(hào)）;廣西重點(diǎn)學(xué)科壯藥學(xué)項(xiàng)目（桂教科研[2013]16號(hào)）;壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心

項(xiàng)目（桂教科研[2013]20號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：洪影雯（1994-），女，廣西北海人，碩士，研究方向?yàn)橹兴幖懊褡逅幤贩N、品質(zhì)及資源開發(fā)，（電話）18376648556（電子信箱）

604217976@qq.com;通信作者，梁子寧，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥及民族藥品種、品質(zhì)及資源開發(fā)研究，（電話）18154515865

（電子信箱）381668307@qq.com。