陳 托， 張立杰， 張麗君， 榮詩闊， 王 振， 彭根遠(yuǎn)， 鞏發(fā)海， 李 海

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科，銀川 750004；3.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兗州院區(qū)呼吸內(nèi)科，濟(jì)寧 272000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。在我國，結(jié)直腸癌居全國惡性腫瘤發(fā)病的第四位，并呈逐年上升的趨勢[1-2]。Piezo2 基因家族可通過機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[3]，推測Piezo2 可能參與了結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（q-PCR）及免疫組織化學(xué)染色方法檢測結(jié)直腸癌及癌旁組織中Piezo2 的mRNA 和蛋白的表達(dá)，分析其與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系，以探討Piezo2 在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

標(biāo)本來源于2015 年10 月至2017 年3 月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院行結(jié)直腸外科手術(shù)的結(jié)直腸癌患者113 例，術(shù)后均經(jīng)病理科確診。獲取結(jié)直腸癌標(biāo)本113 份，同時(shí)取該標(biāo)本相對應(yīng)的癌旁組織（距離癌組織中心＞5 cm）。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療，年齡32～78 歲，平均（53.00±12.27）歲；男64 例，女49 例；直腸癌62 例，結(jié)腸癌51 例。

1.2 主要試劑和儀器

Trizol（Invitrogen，貨號(hào)：15596-026）、反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒（Thermo Fisher，貨號(hào)：00118088）、SYBRRSelect Master Mix（Thermo Fisher，貨號(hào)：4472908）；鼠抗人Piezo2 多克隆抗體（abcam，貨號(hào)ab81327）、超敏二步法試劑盒（北京中杉金橋，貨號(hào)：P6001）、DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋，貨號(hào)：ZL1-9018）；Bio-rad IQ5 儀器等。

1.3 方法

1.3.1 q-PCR 實(shí)驗(yàn) 研磨結(jié)直腸癌及癌旁組織后加入Trizol 裂解液充分裂解，氯仿分離RNA，等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，棄上清液，75%乙醇清洗RNA 沉淀，混勻后離心，加入適量DEPC 水溶解沉淀。然后酶標(biāo)儀檢測260 nm 和280 nm 處的OD 值，測定RNA 溶液濃度和純度。20 μL 體系加樣后在Bio-Rad 儀器上上機(jī)檢測（50℃預(yù)熱2 min，95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火及延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán)）。其中Piezo2 引物：上游5'CGGAATTCATGGCCTCAGAAGTGGTGTGC 3'；下游5'CGGGATCCT CAATTTGTTTTTTCTCTAGTCCATTTGATCATTGT CTCT3' ；內(nèi)參GADPH 引物：5'ACATCAAGAAGG TGGTGAAGCAG3'，5' GTCAAAGGTGGAGGAGTG GGT3'。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法（IHC） 石蠟包埋固定，切片，烤片3 h 脫蠟、脫水，檸檬酸鹽高壓修復(fù)后3% H2O2室溫孵育以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，10%正常山羊血清封閉后滴加一抗Piezo2（1：300）工作液，4℃下孵育過夜，抗鼠二抗孵育1 h，蘇木素染色、鹽酸酒精分化、清水反藍(lán)，脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片，于Leica 正置顯微鏡下觀察并拍照，使用GraphPad 6.0 軟件統(tǒng)計(jì)作圖。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 q-PCR 法結(jié)果判定 采用2-△△Ct分析Ct值計(jì)算結(jié)果：△△Ct=癌組（Ct-Ct 空白）-癌旁組（Ct-Ct 空白）。

1.4.2 IHC 法結(jié)果判定[4]直腸癌組織中Piezo2主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，由病理科醫(yī)師在100 倍鏡下隨機(jī)觀察10 個(gè)視野，根據(jù)著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)分別計(jì)分。染色強(qiáng)度：陰性（-）：無染色，0分；弱（+）：淡黃色，1 分；中（++）：棕黃色，2 分；強(qiáng)（+++）：棕褐色，3 分。IHC 染色后細(xì)胞數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：染色細(xì)胞數(shù)占同類型細(xì)胞數(shù)的百分比＜30%為1 分，30%～60%為2 分，＞60%為3 分。著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分之和≥4 分視為Piezo2蛋白表達(dá)陽性；＜4 分為Piezo2 蛋白表達(dá)陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌和癌旁組織中Piezo2 mRNA 表達(dá)情況

癌組織中Piezo2mRNA 相對表達(dá)倍數(shù)高于癌旁組織（P＜0.01），見圖1。

2.2 結(jié)直腸癌和癌旁組織中Piezo2 蛋白表達(dá)情況

IHC 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織中Piezo2主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，染色為棕褐色，呈強(qiáng)陽性表達(dá)；在癌旁組織中，Piezo2 呈弱陽性或陰性表達(dá)。Piezo2 在結(jié)直腸癌組織的陽性表達(dá)率（68.14%）高于癌旁組織（16.81%）（P＜0.01），見圖2。

2.3 不同臨床特征結(jié)直腸癌組織中Piezo2 蛋白表達(dá)比較

結(jié)直腸癌組織中Piezo2 陽性表達(dá)率隨分化程度增高而降低（P＜0.01），TNM 分期為（玉+Ⅱ）期的結(jié)直腸癌組織中Piezo2 陽性表達(dá)率低于（Ⅲ+Ⅳ）期者（P＜0.01），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中Piezo2 陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.01）；不同年齡、性別、組織學(xué)類型、腫瘤大小、部位的結(jié)直腸癌組織中Piezo2 陽性表達(dá)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見表1。

表1 不同臨床特征的結(jié)直腸癌組織中Piezo2 蛋白表達(dá)比較

3 討論

Piezo 蛋白是一類機(jī)械敏感性離子通道，包括Piezo1 和Piezo2[5-6]，是通過感受細(xì)胞膜表面應(yīng)力變化，實(shí)現(xiàn)胞外機(jī)械信號(hào)向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通道[7-9]。體內(nèi)研究表明，當(dāng)上皮細(xì)胞變得過于擁擠時(shí)，激活Piezo1 通道以擠壓觸發(fā)細(xì)胞[10]，直至細(xì)胞死亡，以保持屏障功能并防止腫瘤形成[11]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Piezo1 可以提供機(jī)械力和細(xì)胞內(nèi)生化途徑激活之間的聯(lián)系結(jié)合促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移[12]，亦可促成膀胱癌的癌變[13]。Piezo 作為直接機(jī)械活化的離子通道，在癌癥發(fā)展中將腫瘤微環(huán)境的機(jī)械特性緊密地聯(lián)系在一起。

Piezo2 蛋白是一類復(fù)雜的跨膜蛋白[8]，其在腸上皮細(xì)胞的功能中發(fā)揮作用[14]。研究證實(shí)，Piezo2 可作為重要的機(jī)械力傳感器感受機(jī)械刺激并將其轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，參與輕觸覺、本體感覺、機(jī)械性痛覺超敏、血管內(nèi)皮細(xì)胞的重排和血管發(fā)育[3，9，14-18]。然而，Piezo2 在機(jī)械刺激下可誘發(fā)Ca2+內(nèi)流而激活下游信號(hào)通路，通過一系列的復(fù)雜信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來促進(jìn)腫瘤血管的生成，并加快細(xì)胞遷移及腫瘤發(fā)展，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，引起如細(xì)胞增殖、血管通透性增加、血管生成、肌動(dòng)蛋白重組以及遷移等反應(yīng)[3，19]。同時(shí)，Piezo2 在多種疾病中如結(jié)腸炎、乳腺癌、喉鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、膀胱癌、膠質(zhì)瘤等均高表

達(dá)[3，13，19-22]。

本研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織中Piezo2 mRNA 及蛋白的陽性表達(dá)率均高于癌旁組織，表明Piezo2 在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起著重要作用。為了進(jìn)一步證實(shí)Piezo2 在結(jié)直腸癌中的作用，通過分析不同臨床特征結(jié)直腸癌組織中Piezo2 蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不同分化程度的結(jié)直腸癌組織中Piezo2 的陽性表達(dá)率隨分化程度增高而降低，且TNM 分期（玉+Ⅱ）期的Piezo2 陽性表達(dá)率低于（Ⅲ+Ⅳ）期。同時(shí)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中Piezo2 陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示Piezo2 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

綜上，Piezo2 蛋白參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，此研究可能為結(jié)直腸癌患者分子水平治療提供新的思路與靶點(diǎn)，其具體機(jī)制及臨床應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。