邢海亮，董訓(xùn)贊，3，韓本勇，耿樹香，寧德魯，馬婷，余旭亞

（1昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500；2云南省林業(yè)與草原科學(xué)院，云南昆明650051；3云南貴澳農(nóng)業(yè)科技集團，云南昆明650100）

近年來，由于微藻具有光合效率高、生長周期短、油脂含量高等優(yōu)勢，被公認為制備生物柴油的新型生物質(zhì)能源[1-2]。然而，較高的生產(chǎn)成本及較低的生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率限制了利用微藻制備生物柴油的工業(yè)化發(fā)展[3-4]。利用廢棄物中的營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)微藻，可以有效地降低微藻生產(chǎn)成本，同時廢棄物得到資源化利用，成為研究熱點[5]。

核桃是營養(yǎng)豐富的堅果，種植廣泛，核桃殼作為核桃產(chǎn)品加工過程中的副產(chǎn)物，可以用于色素的提取、制作活性炭和拋光材料等[6-7]。然而大部分核桃殼卻被就地焚燒，不僅造成了資源的浪費，還會帶來嚴重的環(huán)境污染。研究指出，核桃殼中含有多種微量元素及豐富的多酚物質(zhì)[8]。多酚作為一種抗氧化劑，具有較強的抗氧化性[9]。Zhao 等[10]研究指出，抗氧化劑可以通過調(diào)節(jié)與油脂合成相關(guān)的酶的活性，進而有效促進非生物脅迫下微藻中油脂的積累。此外，在微藻的培養(yǎng)過程中，通入適當濃度的CO2，有利于提高微藻的光合作用效率，促進微藻生物量的積累[11]。有研究指出，在BG-11無碳培養(yǎng)基中，當外源通入5% 的CO2時，小球藻FACHB-1580和柵藻FACHB-1618最大生物量達到3.5g/L 和5.4g/L，分別是對照組的1.41 倍和1.46倍[12]。然而，核桃殼提取液（walnut shell extracts，WSE）聯(lián)合CO2用于微藻培養(yǎng)的研究鮮有報道，研究CO2對WSE中微藻生長和油脂積累的影響，有利于了解CO2作用下WSE中微藻生長和油脂合成的相關(guān)機制。

本文以單針藻Monoraphidium sp. QLZ-3 為對象，以WSE為培養(yǎng)基，研究了外源通入CO2的條件下，微藻生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率的變化及對WSE 中多酚的吸收。同時對微藻細胞內(nèi)核酮糖1,5-二磷酸羧化酶基因（ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，rbcL）相對表達水平和與油脂合成相關(guān)酶的活性進行了檢測。將微藻培養(yǎng)與核桃殼的利用相結(jié)合，為提高微藻的生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率，降低微藻培養(yǎng)成本，以及核桃殼的環(huán)境友好的資源化利用提供一定的指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與培養(yǎng)基的制備

以單針藻Monoraphidium sp. QLZ-3 為研究對象（本實驗室篩選、保存）[13]。稱取適量的核桃殼（云南省林業(yè)科學(xué)院提供）與10倍質(zhì)量的蒸餾水混合，在95℃條件下提取4h，得到褐色的WSE，經(jīng)8層紗布過濾后，添加NaNO3（1.16g/L），調(diào)整pH至6.8～7.0，分裝至生物反應(yīng)器（?0.06m×h0.51m）中，121℃滅菌20min。將單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3接入上述培養(yǎng)基中（初始接種量為0.4g/L），分別通入不同濃度CO2（空氣、4%、8%、12%和16%），氣體流速為0.5L/min，光照強度6500lux，培養(yǎng)溫度25℃±1℃，每組設(shè)置3個平行。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004N 分析天平，LDZX-50KBS 滅菌鍋，VS-840-1超凈工作臺，Ultrospec 2100pro紫外可見分光光度計，RF-540 熒光分光光度計（Shimadzu），5804R 高速低溫離心機（德國Eppendorf 公司），1730R 高速冷凍離心機（丹麥Labogene Scanspeed公司），F(xiàn)D5-12冷凍干燥機（西盟國際集團），Agilent 7890A系列氣相色譜儀（Agilent Technologies）。

1.3 生物量、油脂含量的測定[14]

（1）生物量 每天取10mL（V）藻液，3500r/min 離心10min，去上清液，冷凍干燥后，稱取藻粉質(zhì)量（w1）。微藻生物量Y（g/L）的計算如式(1)。

Y = w1/V (1)

（2）油脂含量 將新鮮的藻液冷凍干燥后，稱取0.3～0.5g（m1）干藻粉與2 倍質(zhì)量的石英砂混合，充分研磨40min，用3mL 氯仿甲醇溶液（2∶1，體積比）提取油脂，于25℃、150r/min 條件下振蕩提取30min后，離心（5000r/min，10min），收集上清液。重復(fù)上述提取操作3 次，合并上清液，置于預(yù)先干燥稱重的離心管（w2）中，40℃干燥至恒重（w3），油脂含量η（%）計算如式(2)。

1.4 CO2固定效率及氣液傳質(zhì)系數(shù)的測定

二氧化碳固定效率依據(jù)式（3）計算[15]。

式中，F(xiàn)CO2為CO2固定效率，mg·L-1·d-1；Pb為生物量產(chǎn)率，mg·L-1·d-1；a 為單位生物量固定CO2的質(zhì)量。

氣液傳質(zhì)系數(shù)[16]測定方法為：先將光生物反應(yīng)器中不含微藻的培養(yǎng)基以99.99%的氮氣曝氣1.5h后，再以不同濃度的CO2曝氣，培養(yǎng)基溫度為25±1℃，測量60min 內(nèi)培養(yǎng)基中溶解CO2濃度的變化，每5min記錄1次，通過氣液傳質(zhì)方程和亨利定律計算傳質(zhì)系數(shù)KLa。計算過程如式(4)。

1.5 rbcL基因表達分析

使用Primer5.0 設(shè)計引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成18S和rbcL酶基因的上下游擴增引物（表1），并以此進行熒光定量PCR。

表1 酶基因熒光定量引物

Trizol 法提取不同濃度CO2處理下單針藻Monoraphidium sp. QLZ-3 內(nèi)的RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進行RT-PCR 擴增，檢測不同濃度CO2處理下單針藻rbcL 基因表達的變化。通過ABI 7500熒光定量儀對rbcL 基因的表達進行定量，RT-PCR的數(shù)據(jù)結(jié)果用2-ΔΔCT（Livak）的方法處理分析。以18s基因作為內(nèi)標以調(diào)節(jié)RNA的用量和循環(huán)數(shù)，使內(nèi)標基因在誘導(dǎo)條件下的表達豐度一致，最終得到基因表達量之間的倍數(shù)關(guān)系。

1.6 多酚含量測定[17]

WSE 中總多酚含量采用Folin-Ciocalteu 法測定：稱取干燥至恒重的沒食子酸10.0mg，加入到蒸餾水中定容至100mL。分別取0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL 和0.9mL 沒食子酸溶液于10mL 的比色管中，加入Folin-Ciocalteu 試劑0.5mL，1min 后加入碳酸鈉溶液1.5mL（200g/L），用蒸餾水定容至刻度線處，混勻，40℃保溫2h 后，迅速冷卻。在760nm 處測定吸光度，建立標準曲線。按照上述方法測定樣品中多酚的含量。

1.7 酶活性測定[18]

單針藻Monoraphidium sp. QLZ-3 中蘋果酸酶（malic enzyme，ME）、乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl coenzyme A carboxylase，ACCase）和磷酸烯醇式丙酮 酸 羧 化 酶 （phosphoenolpyruvatecarboxylase，PEPC）的活性使用比色定量試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定。

1.8 脂肪酸組成分析

將2mL 3%的硫酸-甲醇（體積比）溶液加入到烘干的油脂中，70℃回流2h 后，加入2mL 正己烷震蕩提取4h，取正己烷相進行氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析[19]。

1.9 統(tǒng)計分析

本文全部實驗均設(shè)置3 組平行,利用ANOVA(SPSS19.0)一步法分析實驗數(shù)據(jù)，P＜0.05表示差異顯著，后文中用“*”表示；P＜0.01表示差異極顯著，后文中用“**”表示。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 CO2對WSE中單針藻生物量的影響

不 同 濃 度 的 CO2對 WSE 中 單 針 藻Monoraphidium sp. QLZ-3 生長的影響如圖1 所示。在培養(yǎng)過程中，隨著CO2濃度的不斷提高，微藻的生物量逐漸增加，當CO2濃度達到12%時，微藻的生物量達到最高，為1.18g/L，是對照組的1.33倍。繼續(xù)增加CO2的濃度，微藻的生物量出現(xiàn)下降趨勢。近期研究指出，向糖蜜酒精廢醪液中添加褪黑素，單針藻Monoraphidium sp. QLY-1 的生物量達到1.22g/L[1]，相比對照組提高了41.82%；在80mg/L黃腐酸的作用下，微藻的生物量提高了52.26%[9]。諸多研究表明，在微藻的生長過程中，通入適當濃度的CO2，可以促進微藻光合作用的進行，使得藻細胞快速生長[11,20]。有研究指出，當向生活污水中通入2.5%的CO2時，柵藻的生物量達到1.37g/L，是對照組的1.54 倍[21]。適宜濃度的CO2有助于微藻的生長，但當CO2的濃度超過一定的范圍時，微藻的生長就會受到抑制[22]。這與本實驗結(jié)果一致，將WSE中的CO2濃度增加至16%時，微藻的生長受到抑制（圖1）。這是由于持續(xù)通入高濃度的CO2會迅速降低溶液pH，可能抑制相關(guān)酶活性，從而使微藻的生物量降低[12]。

圖1 不同濃度CO2對WSE中單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3生物量的影響

2.2 CO2 對WSE 中單針藻油脂及生物量產(chǎn)率的影響

如圖2 所示，當WSE 中CO2的濃度為12%時，單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3 的油脂含量最高，為49.54%，是對照組的1.18 倍。此時，生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率為196.85mg/(L·d)和97.52mg/(L·d)，分別是對照組的1.33 倍和1.57 倍。相關(guān)研究指出，利用養(yǎng)豬廠廢水培養(yǎng)微藻，油脂含量最高可達28.8%，相比對照組提高了53.76%[23]；利用水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)柵藻LX1，其油脂含量可達到31.6%[24]。相關(guān)研究表明，由于微藻中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)運機制的存在，適當濃度的CO2可以促進微藻的生長和積累脂類[25]。當BG-11 培養(yǎng)基中通入5% 的CO2時，柵藻Scenedesmus sp. FACHB-1600 的油脂產(chǎn)率達到104.163mg/(L·d)，相比對照組提高了51.15%[22]。本實驗結(jié)果表明，適宜濃度的CO2有助于WSE中單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3的生長油脂積累，提高生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率。

圖2 不同濃度CO2對微藻油脂含量、生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率的影響

此外，WSE的制備成本為CNY25.05/t（天然氣價格為CNY2.4/m3，水價格為CNY3.45/t），在12%的CO2作用下，微藻生物量和油脂的原料成本分別為CNY21.23/kg 和CNY42.85/kg。研究指出，利用傳統(tǒng)培養(yǎng)基BG-11 培養(yǎng)柵藻Scenedesmus SDEC-13時，微藻生物量和油脂培養(yǎng)的原料成本則分別為CNY144.00/kg和CNY709.01/kg[26]。結(jié)果表明，WSE聯(lián)合CO2用于微藻的培養(yǎng)可以降低微藻生物柴油制備的原料成本。

2.3 CO2固定效率及傳質(zhì)效率

不同濃度的CO2對WSE 中傳質(zhì)系數(shù)（KLa）及微藻對CO2的固定效率的影響如圖3 所示。在微藻的培養(yǎng)過程中，隨著CO2濃度的增加，KLa值逐漸增加。當CO2的濃度為12%時，KLa值為0.073min-1，此時CO2的固定效率最高，達到0.36g CO2/(L·d)。結(jié)果表明，當CO2的固定效率最高時，單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3的生物量產(chǎn)率及油脂產(chǎn)率達到最大（圖2）。而當CO2的濃度為16%時，雖然KLa值增加至0.081min-1，但CO2的固定效率下降至0.36g CO2/(L·d)（圖3），微藻的生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率也分別下降至174.05mg/(L·d)和74.97mg/(L·d)（圖2），這可能是由于較高的CO2濃度限制了微藻的生長[27]。本實驗結(jié)果顯示，當KLa值為0.073min-1時，WSE 中有足夠的持續(xù)的CO2供給微藻的生長，而當KLa值增加0.081min-1時，由于CO2濃度過高而降低了其固定效率，從而使微藻的生長（圖1）和油脂積累（圖2）降低。

圖3 不同濃度CO2在WSE中對CO2的固定（柱形圖）及傳質(zhì)效率（折線圖）的影響

2.4 WSE中多酚含量變化

圖4 不同濃度CO2下WSE中多酚含量變化

多酚具有很強的抗氧化特性，可以減緩細胞的氧化損傷[9]。Zhao 等[10]研究指出，抗氧化劑可以通過調(diào)節(jié)油脂合成相關(guān)途徑，進而促進微藻中油脂的積累。由圖4可知，在微藻的培養(yǎng)過程中，WSE中的多酚含量逐漸降低。Lu等[28]指出，多酚是一種微量營養(yǎng)元素，可被細胞吸收利用。在CO2的濃度為12%的條件下，WSE 中的多酚含量從65.87mg/L 下降至41.09mg/L，相比對照組降低了16.00%。圖1表明，12%的CO2促進了微藻的生長，WSE中更多的多酚被單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3吸收（圖4），從而促進了微藻中油脂含量的積累（圖2）。Paz-Yépez 等[17]研究指出，多酚可以阻礙自由基與脂質(zhì)分子的結(jié)合，從而減少由于脂質(zhì)氧化引起的細胞損傷，促進油脂的積累。褪黑素作為一種抗氧化劑（melatonin，MT），1μmol/L 的MT作用下，單針藻Monoraphidium sp. QLY-1 的油脂含量達到49.6%，是同等條件下對照組的1.32倍[29]。Che等[18]研究表明，抗氧化劑促進微藻的生長和油脂的積累，與油脂合成相關(guān)酶的活性及酶基因的表達有關(guān)。

2.5 CO2 對單針藻中與油脂合成相關(guān)酶活性的影響

ACCase 是一種依賴生物素的變構(gòu)羧化酶，主要催化依賴ATP 的乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A）轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，是脂肪酸合成過程中的限速酶[1,28]。在CO2的作用下，單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3 中，ACCase 的活性變化如圖5 所示，隨著CO2濃度的增加，藻細胞內(nèi)ACCase 的活性逐漸增強，當CO2濃度的增加至12%時，ACCase 的活性最大，達到對照組的1.23～1.38 倍。繼續(xù)增加CO2的濃度，ACCase的活性開始下降。前人研究指出，由ACCase 催化生成的丙二酰輔酶A 可以有效抑制脂肪酸的氧化[30]。通過上調(diào)ACCase 的活性，可以促進衣藻Chlamydomonas reinhardtii 油脂含量的提高[1]。本實驗研究結(jié)果顯示，向WSE中通入適宜濃度的CO2，可以提高單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3中ACCase的活性，促進油脂的積累。

圖5 不同濃度CO2對微藻中ACCase活性的影響

蘋果酸在ME 的作用下降解為丙酮酸，還原NADP+，為脂肪酸的合成提供足夠的NADPH[1]。如圖6所示，CO2促進了微藻中ME活性的提高。培養(yǎng)第2 天時，ME 活性的提高最大，是對照組的2.60倍。在脂肪酸合成的過程中，脂肪酸合成酶可利用由ME 還 原 得 到 的NADPH[31]。 在 單 針 藻Monoraphidium sp. QLZ-3 的培養(yǎng)過程中，ME 的活性始終高于對照組（圖6），這就為微藻油脂的合成提供了足夠的NADPH，促進了微藻油脂的積累（圖2）。Xue 等[32]研究指出，通過提高ME 的活性，三角褐指藻的油脂含量提高了2倍。這與本實驗結(jié)果一致，CO2促進了微藻中ME 的活性，進而促進了微藻油脂含量的提高。

圖6 CO2作用下微藻中ME活性的變化

圖7 不同濃度CO2對單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3中PEPC活性的影響

PEPC 是光合作用C4途徑中的關(guān)鍵酶之一，催化磷酸烯醇式丙酮酸的β-C羧基化并生成草酰乙酸和無機磷酸，它與ACCase 之間存在著底物的競爭[33-34]。在微藻培養(yǎng)過程中，實驗組和對照組中PEPC 的活性均出現(xiàn)先降低后增加的趨勢，但實驗組中的PEPC活性始終低于對照組（圖7）。培養(yǎng)前期，ACCase和ME的活性較高（圖5和圖6），油脂合成較快，PEPC的活性逐漸下降（圖7），培養(yǎng)后期，ACCase和ME的活性較低（圖5和圖6），油脂緩慢合成，PEPC活性開始逐漸增高。Ghosh等[25]研究指出，通過上調(diào)衣藻Chlamydomonas reinhardtii中PEPC的活性，其油脂含量下降了37%。而PEPC基因的敲除，促進了三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum中油脂的積累[35]。本實驗結(jié)果表明，CO2可以降低單針藻Monoraphidium sp. QLZ-3 中PEPC的活性，促進微藻油脂的積累。

2.6 CO2對WSE中單針藻rbcL基因表達量的影響

單針藻Monoraphidium sp. QLZ-3 中rbcL 基因相對表達量的變化見圖8。在CO2的作用下，微藻細胞內(nèi)rbcL 基因的相對表達量均有不同程度的增加。與對照組相比，當CO2的濃度為12%時，在培養(yǎng)的1～3 天，rbcL 基因的相對表達量從1.64倍增加至2.63倍，隨后開始下降，到第6天時下降至1.49 倍。Ikaran 等[36]研究表明，rbcL 基因與CO2的固定有關(guān)，其表達量的上調(diào)可以加快光合作用固碳。圖8 表明，12%的CO2作用下微藻中rbcL 基因表達量上調(diào)，促進了微藻對CO2的吸收，為微藻的生長提供更多的碳骨架，從而促進了微藻的生長（圖1）和CO2的固定（圖3）。Che 等[18]研究表明，微藻固定的CO2用于合成糖、脂質(zhì)等生物大分子。缺氮條件可以促進小球藻chlorella vulgaris var L3中rbcL 基因表達量的上調(diào)，油脂含量增加了25%[36]。本實驗結(jié)果顯示，12%的CO2上調(diào)了rbcL基因表達量，促進了CO2的固定、微藻的生長及油脂的積累。

圖8 不同濃度CO2對單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3的rbcL基因相對表達量影響

2.7 WSE中單針藻脂肪酸的組成分析

單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3脂肪酸的組成如表2 所示，C16∶0（16 表示脂肪酸碳鏈的長度，0表示碳鏈上不飽和鍵的個數(shù)）、C18∶1、C18∶2和C18∶3是微藻脂肪酸的主要成分。與對照組相比，12%的CO2作用下，微藻中的C16∶0 含量增加了36.27%，而C18∶2的含量則減少了34.15%，C18∶1和C18∶3 的含量基本保持不變，這就導(dǎo)致了實驗組中飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFAs）含量上升，多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）含量下降，單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）含量保持不變。12%的CO2作用下的實驗組中不飽和度（degree of unsaturation，DU）為103.83，相比對照組下降了15.48%，可作為生產(chǎn)生物柴油的原料[37]。此外，WSE中所培養(yǎng)微藻脂肪酸的長鏈飽和因子（long chain saturation factor，LCSF）和冷濾點（cold filter plugging point，CFPP）如表2 所示。LCSF 是用來計算生物柴油的CFPP值的，CFPP值越低，生物柴油的低溫流動性能越好。由于各國所處的環(huán)境不同，對CFPP 值也有不同的規(guī)定，而歐洲柴油標準并未對生物柴油的CFPP 值提出具體的要求，但我國（GB/T25199—2010）規(guī)定其值不高于-5～12℃。本實驗結(jié)果表明，以WSE 為培養(yǎng)基，培養(yǎng)微藻得到的脂肪酸符合生產(chǎn)生物柴油的標準。

3 結(jié)論

本文研究了不同濃度的CO2對WSE 中單針藻Monoraphidium sp. QLZ-3 生長和油脂積累的影響。12%的CO2上調(diào)了rbcL 基因的表達量，加快了CO2的固定效率和多酚的吸收，同時上調(diào)了ACCase 和ME 的活性，下調(diào)了PEPC 的活性，提高了單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3的生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率。綜上，CO2聯(lián)合WSE培養(yǎng)微藻，為微藻的工業(yè)化培養(yǎng)和核桃殼的綜合利用提供了新的思路。

表2 不同CO2濃度對WSE中單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3脂肪酸的組成的影響