鄧秀娟 劉 雨 譚光波 譚宇軍

（湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410100）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是呼吸系統(tǒng)常見的一種以氣流阻塞為特征的慢性疾病，其發(fā)病率、致殘率、死亡率較高，嚴(yán)重危害人類健康［1］。氣道黏液高分泌是COPD重要病理生理特征之一，與COPD發(fā)生、發(fā)展、臨床結(jié)局密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，伴有慢性咳嗽、咯痰等氣道黏液高分泌癥狀的人群，其罹患COPD的風(fēng)險(xiǎn)、氣道阻塞程度、急性加重頻率明顯增加［2］。麻杏二三湯是臨床治療哮喘及COPD（痰濁阻肺證）有效驗(yàn)方，臨床療效顯著，但其多局限于臨床研究，在氣道黏液高分泌機(jī)制研究中少見報(bào)道。本研究通過觀察麻杏二三湯對(duì)COPD氣道黏液高分泌大鼠模型肺組織氣道酚紅排泌量及黏蛋白MUC5AC、MUC5B表達(dá)的影響，探討麻杏二三湯治療COPD氣道黏液高分泌的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，36只，鼠齡10～12周，體質(zhì)量（230±20）g，湖南省斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SYXK（湘）2016-0002］。

1.2 試藥與儀器 麻杏二三湯方藥組成：炙麻黃6 g，杏仁10 g，化橘紅12 g，制半夏10 g，茯苓15 g，炒紫蘇子10 g，萊菔子10 g，白芥子6 g，炙甘草6 g，生姜5～7片。中藥飲片購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中心藥房；一煎按生藥量加入10倍水，煎煮1 h后保存藥液，藥渣再加入8倍量水，煎煮1 h，過濾，合并濾液濃縮成所需濃度。白沙煙（湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，焦油量15 mg/支，煙氣煙堿量0.9 mg/支）；脂多糖（美國Sigma公司）；阿奇霉素分散片（石家莊四藥有限公司）；PAS染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、UltraSYBR Mixture（北京康為世紀(jì)）；β-actin、MUC5AC、MUC5B引物（上海生工）；Tris、APS、SDS、TEMED、丙烯酰胺、甘氨酸（美國Sigma公司），RIPA裂解液（長沙維世爾生物試劑有限公司）；蛋白酶抑制劑（德國Merck）；小鼠MUC5AC、MUC5B單克隆抗體（美國SantaCruz公司）；HRP goat anti-rabbit IgG、HRP goat anti-mouse IgG（美國Proteintech公司）；Super ECL Plus超敏發(fā)光液（美國Thermo pierce公司）。自制有機(jī)玻璃熏煙箱（1.5 m×1 m×1 m大小，72 L）；切片機(jī)（萊卡，M199）；多功能顯微鏡和數(shù)字圖像分析儀（Motic，BA410B）；-80℃冰箱（中科美菱，DW-HL388）；恒溫水浴箱（河南金博，HH-S2）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（eppendorf，TGL-18R）；搖床（江蘇其林貝爾，TS-92）；電泳儀（美國 Bio-rad，164-5050）；轉(zhuǎn)膜儀（北京六一，DYCZ-40A）；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（英國Syngene G公司）；熒光PCR板（Thermo，SPL0960）；熒光定量RCP儀（Thermo，PIKO REAL 96）。

1.3 分組與造模 SD雄性大鼠36只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組，模型組，阿奇霉素組，麻杏二三湯低、中、高劑量組，各6只。COPD氣道黏液高分泌大鼠模型制作參考王?。?］COPD模型制備。各造模組動(dòng)物于第1、14日大鼠麻醉后氣管內(nèi)滴入LPS 200 μg；第2～28日給予大鼠每日2次香煙煙熏（每次15根，每次1 h）。

1.4 給藥方法 大鼠給藥劑量參考人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表，大鼠的等效劑量相當(dāng)于人的6.3倍，每只動(dòng)物每千克體質(zhì)量給藥量按臨床人（70 kg）的等效量為中劑量，0.5倍等效量為低劑量，2倍等效量為高劑量。大鼠麻杏二三湯低劑量、中劑量、高劑量生藥量分別為4.3、8.6、17.2 g/kg，阿奇霉素為22.5 mg/kg。給藥體積按照10 mL/kg灌胃量予不同濃度麻杏二三湯及阿奇霉素灌胃，每日1次，模型組予等量0.9%氯化鈉注射液。各組于末次給藥后，禁食12 h，麻醉狀態(tài)下處死動(dòng)物，留取肺組織。肺組織固定于4%多聚甲醛行病理學(xué)檢測(cè)，于液氮中行PCR、WB檢測(cè)。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）大鼠一般情況：觀察大鼠體質(zhì)量、活動(dòng)狀況、毛發(fā)、咳嗽、氣喘及口鼻分泌物等。2）肺組織形態(tài)學(xué)觀察：采用HE染色法。石蠟包塊切片，二甲苯、乙醇脫蠟至水，蘇木素浸染，鹽酸乙醇分化，伊紅溶液復(fù)染，再脫水透明封片，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變。3）大鼠肺功能檢測(cè)：大鼠麻醉后分離暴露氣管，進(jìn)行氣管插管并固定，用小動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀測(cè)定肺阻力（RI）和肺順應(yīng)性（Cdyn）。酚紅排痰實(shí)驗(yàn)參考趙娜妹等［4］研究，大鼠腹腔注射7.05 mmol/L酚紅溶液0.5 mL，0.5 h后處死分離氣管，留取環(huán)狀軟骨至氣管分叉處氣管，0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液反復(fù)沖洗3次，合并沖洗液注入比色管中，用721分光光度計(jì)（546 nm）測(cè)定光密度，根據(jù)酚紅的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酚紅排泄量。4）肺組織MUC5AC、MUC5B蛋白表達(dá)：采用Western blotting法。RIPA裂解肺組織提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入小鼠MUC5AC、MUC5B單克隆抗體（1∶200），β-actin（1∶5 000），4℃冰箱孵育過夜；孵育結(jié)束TBST洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠二抗和兔二抗（1∶5 000），室溫下孵育1.5 h，充分洗滌后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，暗室曝光沖印，BioRad成像系統(tǒng)分析電泳條帶，Quantity One圖像分析軟件計(jì)算3個(gè)基因與β-actin比值。5）肺組織MUC5AC、MUC5B基因表達(dá)：采用熒光定量RT-PCR法。取1 mL Trizol提取肺組織總RNA，1%變性瓊脂糖凝膠鑒定，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度，參照HiFiScript cDNA Synthesis Kit和UltraSYBR Mixture合成試劑盒進(jìn)行兩步法RT-PCR。以與內(nèi)參β-actin mRNA的比值，作為目的基因mRNA的相對(duì)值。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以（±s）表示。符合正態(tài)性及方差齊性資料，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）；不滿足正態(tài)性或方差齊性數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 見表2。造模大鼠經(jīng)煙熏及脂多糖處理后偶可聞及氣道痰鳴音，毛發(fā)干枯，活動(dòng)量減少，體質(zhì)量較正常組明顯下降（P＜0.01）。與模型組比較，第42日阿奇霉素組及中藥中、高劑量組體質(zhì)量明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

與模型組同時(shí)期比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與正常組同時(shí)期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組別正常組模型組阿奇霉素組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 6 6 6 6 6 6第1日249.40±13.51 248.80±14.06 250.80±14.06 251.50±13.45 250.10±12.01 252.70±14.73第28日455.20±34.28 358.40±41.97△△389.40±17.34△△374.40±19.11△△355.40±22.15△△382.60±24.81△△第42日532.20±29.52 403.60±17.49△△422.80±6.14△△*417.40±12.74△△425.00±17.56△△**454.20±11.65△△**

2.2 各組大鼠肺功能比較 見表3。與正常組比較，模型組大鼠Cdyn明顯降低，RI明顯增高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及阿奇霉素組大鼠RI明顯減低（P＜0.05）；中藥高劑量組及阿奇霉素組Cdyn明顯增加（P＜0.05）。

表3 各組大鼠肺功能比較［cmH2O/（mL·s），±s］

組別正常組模型組阿奇霉素組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n6 6 6 6 6 6 RI 0.85±0.55 2.39±0.64△△1.41±0.81*1.54±0.48*1.51±0.35*1.36±0.88**Cdyn 0.61±0.17 0.28±0.07△△0.44±0.14*0.38±0.15△△0.40±0.11△△0.46±0.15*

2.3 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察 見圖1。空白組大鼠HE染色小氣道黏膜上皮完整，管壁規(guī)整，無炎性細(xì)胞浸潤，肺泡腔無病理性擴(kuò)大。造模組大鼠HE染色可見大小不一的肺小泡形成，肺泡間隔破壞，小支氣管擴(kuò)張，氣管上皮黏膜脫落，氣管壁變型，管腔內(nèi)痰黏潴留，管壁周圍及肺間質(zhì)可見淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤。

2.4 各組大鼠氣道酚紅排泌量比較 見表4。與正常組比較，模型組大鼠氣管酚紅排泌量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，阿奇霉素組及中藥中、高劑量組大鼠氣管酚紅排泌量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）。

圖1 各組肺組織HE染色（肺泡及肺泡間隔，100倍；細(xì)支氣管，400倍）

表4 各組大鼠氣道酚紅排泌量比較（μg/mL，±s）

表4 各組大鼠氣道酚紅排泌量比較（μg/mL，±s）

?

2.5 各組大鼠肺組織MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表達(dá)比較 見表5。與正常組比較，模型組大鼠肺組織MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA基因表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，中藥中、高劑量組及阿奇霉素組MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA基因表達(dá)明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），中藥低劑量組MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 各組大鼠肺組織MUC5AC、MUC5B基因表達(dá)比較（±s）

表5 各組大鼠肺組織MUC5AC、MUC5B基因表達(dá)比較（±s）

?

2.6 各組大鼠肺組織MUC5AC、MUC5B蛋白表達(dá)比較 見表6。與正常組比較，模型組肺組織黏蛋白MUC5AC、MUC5B蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，阿奇霉素組及中藥高劑量組MUC5AC、MUC5B表達(dá)顯著下降（P＜0.05），中藥中劑量組MUC5B蛋白明顯降低（P＜0.05）。

表6 各組大鼠肺組織MUC5AC、MUC5B蛋白表達(dá)比較（±s）

表6 各組大鼠肺組織MUC5AC、MUC5B蛋白表達(dá)比較（±s）

組別正常組模型組阿奇霉素組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 6 6 6 6 6 6 MUC5AC 0.14±0.04 0.24±0.09△0.14±0.05*0.23±0.08 0.19±0.05 0.14±0.12*MUC5B 0.16±0.07 0.29±0.06△△0.17±0.06**0.24±0.03△0.21±0.04*0.17±0.07**

圖2 各組大鼠肺組織MUC5AC、MUC5B蛋白相對(duì)含量

3 討論

氣道黏液高分泌是COPD重要病理生理特征之一，慢性黏液高分泌與COPD患者FEV1的加速下降和住院時(shí)間的增加密切相關(guān)［5］。氣道黏液由氣管、支氣管分泌，是杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白及黏膜下腺體分泌的水、糖類、蛋白質(zhì)、脂類及礦物質(zhì)的混合物，黏蛋白雖然僅占?xì)獾鲤ひ旱?%，黏蛋白糖基組成的變化卻是引起黏液理化特性改變的主要原因。在成人呼吸道分泌的黏蛋白中，MUC5AC和MUC5B是主要分泌物，氣道黏液高分泌過程中MUC5AC和MUC5B表達(dá)明顯升高，尤以MUC5AC異常升高為主［6］。

COPD屬于中醫(yī)學(xué)“喘證”“咳嗽”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“痰飲”貫穿其發(fā)生、發(fā)展始終，氣道黏液高分泌可能就是中醫(yī)學(xué)之“痰飲”。麻杏二三湯出自焦樹徳教授，其組方由二陳湯、三子養(yǎng)親湯加麻黃、杏仁而成，方中二陳湯理氣健脾，燥濕化痰，為治一切痰飲之通劑。三子養(yǎng)親湯之白芥子溫肺利氣化痰、萊菔子下氣消痰定喘、蘇子降氣止咳平喘，三藥合用降逆化痰平喘。配伍麻黃宣肺平喘，杏仁降氣平喘，宣降有度，全方共奏健脾燥濕、降氣止咳平喘之功。臨床治療肺源性心臟病、慢性支氣管炎、哮喘、COPD屬痰濁阻肺證療效顯著［7-11］。

本研究采用煙熏聯(lián)合脂多糖建立大鼠COPD模型，模型組大鼠肺功能肺阻力明顯增加，肺順應(yīng)性明顯降低，病理學(xué)符合COPD慢性支氣管炎及肺氣腫病理改變，氣道酚紅排泌量明顯增多，提示構(gòu)建的模型符合COPD氣道黏液高分泌模型。與模型組比較，阿奇霉素組及中藥中、高劑量組能明顯降低氣道酚紅排泌量、黏蛋白MUC5AC、MUC5B基因及蛋白表達(dá)及肺阻力。結(jié)果提示麻杏二三湯能明顯改善COPD大鼠肺功能，作用機(jī)理可能與減少氣道黏液高分泌有關(guān)，其藥效隨著濃度增加而增強(qiáng)。臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明二陳湯及三子養(yǎng)親湯均能通過抑制氣道黏液高分泌延緩COPD和哮喘肺功能下降［12-14］。

本研究初步從氣道黏液高分泌探討了麻杏二三湯對(duì)COPD大鼠黏蛋白MUC5AC、MUC5B的影響，證實(shí)麻杏二三湯可通過抑制黏蛋白MUC5AC、MUC5B表達(dá)抑制氣道黏液高分泌，為麻杏二三湯治療痰濁阻肺之喘證提供了理論基礎(chǔ)及臨床指導(dǎo)。但氣道黏液高分泌涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、蛋白酶失衡及膽堿能神經(jīng)功能紊亂等多種病理生理機(jī)制，且黏蛋白分泌包括基因調(diào)節(jié)、蛋白合成及分泌釋放全過程，因此，麻杏二三湯對(duì)黏蛋白分泌的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。