任婷玉 廖奕浪 黃婷婷 王靜 肖曉蔚 韋唯 周義文

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A 屬，是球形DNA 病毒，HPV 有眾多亞型，目前已分離出170 多種，不同的型別對(duì)宮頸上皮細(xì)胞的侵襲力不同［1］，其中HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59 和HPV-68 等亞型主要跟宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌相關(guān)，為高危型。HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43 和HPV-44 等亞型與尖銳濕疣等外生殖器良性病變有關(guān)，為低危型。許多研究表明高危型HPV 的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌的直接病因［2-4］。宮頸癌嚴(yán)重威脅女性健康，據(jù)統(tǒng)計(jì)2015年中國(guó)新增了98 900例宮頸癌病例，并有30 500例宮頸癌相關(guān)的死亡病例［5］。因此有效控制HPV 感染對(duì)于宮頸癌的防控有重要意義。但由于HPV 分型眾多，不同型別的致癌能力相差很大，而我國(guó)地廣人多，不同地區(qū)與不同人群之中感染的HPV 型別分布也存在較大差別［6-7］。據(jù)報(bào)道一些貧窮國(guó)家的宮頸癌病死率比發(fā)達(dá)國(guó)家高出兩倍。改革開(kāi)放40年來(lái)，沿海城市經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，人口流動(dòng)性增大，居民生活方式發(fā)生較大改變。深圳作為改革開(kāi)放的前沿窗口，地少人多，具有一定代表性。本研究利用核酸分子快速雜交分型技術(shù)對(duì)門(mén)診和體檢人群生殖道HPV 感染進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)深圳地區(qū)HPV 的感染情況進(jìn)行分析，希望為本地區(qū)宮頸癌防治措施的制定提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對(duì)象標(biāo)本來(lái)源于南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院2016年5月至2018年8月婦科門(mén)診和體檢中心接受HPV 分型檢測(cè)的婦女9 409例。年齡18～79 歲，平均（40 ± 9.63）歲。按照患者的年齡階段分為五組，其中18～30 歲為A 組，共1 665例，31 ～40 歲為B 組，共3 666例，41 ～50 歲為C 組，共2 646例，51 ～60 歲為D 組，共1 087例，61 ～80 歲為E組，共345例。根據(jù)液基細(xì)胞學(xué)（TCT）細(xì)胞病理結(jié)果將6 201例調(diào)查對(duì)象分為未見(jiàn)上皮內(nèi)病變或惡性病變（NILM）組，宮頸炎癥（cervitis）組，非典型鱗狀上皮細(xì)胞增生（ASC）組，低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）組，高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）組。觀察細(xì)胞病變嚴(yán)重性與HPV 感染的關(guān)系。收集2016年5月至2017年4月調(diào)查對(duì)象的臨床資料進(jìn)行HPV 感染的危險(xiǎn)因素分析。本研究?jī)?nèi)容已由醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：NYSZYYEC20190005）。

1.1.2 試劑和儀器試劑使用亞能公司生產(chǎn)的HPV DNA 基因分型檢測(cè)試劑盒。Thermo arktik96型PCR 擴(kuò)增儀，由美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司生產(chǎn)。全自動(dòng)核酸分子快速雜交儀由亞能公司提供。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集標(biāo)本采集要求在非月經(jīng)期進(jìn)行，且在采集標(biāo)本前至少1 d 禁止性生活，在采集標(biāo)本前至少3 d 停止使用所有陰道內(nèi)的藥物。標(biāo)本按照宮頸細(xì)胞學(xué)取材要求和步驟進(jìn)行取樣：患者臥床采取截石位，利用窺陰器對(duì)患者的宮頸進(jìn)行充分暴露，用無(wú)菌棉拭子擦掉宮頸口的分泌物和粘液，然后將宮頸刷于宮頸口處輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)5 圈，使其順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)，取出宮頸刷，把采集到的標(biāo)本放置在加有細(xì)胞保存液的專(zhuān)用取樣管中，擰緊瓶蓋，立刻送實(shí)驗(yàn)室檢查，或4 ℃保存待檢（存放2 d），或-20 ℃長(zhǎng)期保存。

1.2.2 HPV分型檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)23種HPV病毒DNA 分型，分為高危型和低危型兩類(lèi)，高危型17 種亞型，包括HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-66、HPV-68、HPV-73、HPV-82；低危型包括HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43、HPV-81、HPV-83。檢測(cè)步驟為：（1）HPV-DNA 分離提?。唬?）HPV-DNA PCR 擴(kuò)增及變性；（3）核酸分子雜交；（4）顯色（檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性為藍(lán)色圓點(diǎn)）；（5）結(jié)果讀?。篒C（內(nèi)對(duì)照）點(diǎn)為陽(yáng)性，其他點(diǎn)為陰性，判定HPV 分型DNA 檢測(cè)結(jié)果為陰性；IC（內(nèi)對(duì)照）點(diǎn)為陽(yáng)性，其他有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)為陽(yáng)性，判定相應(yīng)HPV 分型DNA 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性（單個(gè)或多個(gè)HPV 型別感染）。具體操作步驟詳見(jiàn)試劑及儀器說(shuō)明書(shū)，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程檢測(cè)。

1.2.3 TCT檢測(cè)待檢宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)制片、95%酒精固定、染色后鏡檢。根據(jù)TBS（the bethesda system）分級(jí)診斷標(biāo)準(zhǔn)閱片，分類(lèi)為：未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM），非典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cells，ASC），低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL），高度鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)；危險(xiǎn)因素分析采用二元Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各年齡段患者HPV 感染情況HPV 分型檢測(cè)檢出陽(yáng)性患者2 740例，總陽(yáng)性率為29.12%（2 740/9 409），多重感染未重復(fù)計(jì)算，HPV感染率B組（31 ～40歲）最高，其次是E組（61 ～80歲）和A組（18 ～30 歲），C 組（41 ～50 歲）HPV 感染率最低。HPV 陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 342.92，P＜0.001），見(jiàn)表1。

表1 各年齡段患者例數(shù)、HPV 陽(yáng)性數(shù)和陽(yáng)性率Tab.1 The age distribution of the HPV prevalence rate

2.2 HPV 感染型別分析在HPV 檢測(cè)陽(yáng)性病例中，主要為高危型HPV 感染。高危型HPV 共檢出陽(yáng)性2 187例，低危型HPV 共檢出陽(yáng)性553例。在高危型HPV 感染中，以HPV-52、HPV-16、HPV-58、HPV-53、HPV-51 為主，感染率最高的是HPV-52；在低危型HPV 感染中，以HPV-81、HPV-42、HPV-43 為主，感染率最高的是HPV-81。見(jiàn)表2。

2.3 HPV 感染率與宮頸細(xì)胞學(xué)病變的分析將同時(shí)進(jìn)行液基細(xì)胞學(xué)和HPV 分型檢測(cè)的對(duì)象根據(jù)液基細(xì)胞學(xué)結(jié)果分為5組：未見(jiàn)上皮內(nèi)病變（NILM）組，共5 527例；宮頸炎癥（cervitis）組，共129例；非典型鱗狀上皮細(xì)胞增生（ASC）組，共410例；低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變（ISIL）組，共76例；高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變（HSIL）組，共59例。各組HPV 感染陽(yáng)性率分別為16.08%、27.91%、63.66%、88.16%、94.92%，HPV陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=931.24，P＜0.001）。見(jiàn)表3。

表3 各級(jí)別細(xì)胞病變例數(shù)、HPV 陽(yáng)性數(shù)和陽(yáng)性率Tab.3 The analysis of TCT result and HPV infection

2.4 HPV感染危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析HPV感染作為因變量，危險(xiǎn)因素作為自變量分析如表4所示。初次性生活年齡是HPV 感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=3.444，P＜0.001）。

表4 HPV 感染危險(xiǎn)因素的Logistic 回歸分析Tab.4 Binary Logistic Regression of the risk factors for the HPV infection

3 討論

人乳頭瘤病毒具有嗜鱗狀上皮細(xì)胞的特點(diǎn)，通過(guò)引起皮膚黏膜的上皮增殖導(dǎo)致疾病發(fā)生，高危型HPV 持續(xù)感染是女性宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌發(fā)生發(fā)展的首要原因［8］。HPV 分型檢測(cè)和TCT檢測(cè)是宮頸癌篩查的重要手段，本研究通過(guò)回顧性分析2016-2018年研究對(duì)象的HPV 分析和TCT檢測(cè)結(jié)果，收集到近萬(wàn)份樣本的檢測(cè)數(shù)據(jù)和臨床資料，樣本量領(lǐng)先于國(guó)內(nèi)同類(lèi)型研究。HPV 亞型的分布具有地域性，不同地區(qū)和民族的人群HPV感染型別具有較大差別，較大的樣本量有益于準(zhǔn)確獲得HPV 流行特征。隨著HPV 疫苗的接種和人群預(yù)防意識(shí)的加強(qiáng)，HPV 的感染特征也出現(xiàn)變化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)深圳地區(qū)女性HPV 總感染率為29.12%，HPV 感染主要以高危型為主，其中以HPV-52 型（4.72%）感染率最高，其次是HPV-16 型（2.71%）和HPV-58 型（2.57%）。陳波等［9］對(duì)廣州地區(qū)2011-2013年HPV 感染的調(diào)查顯示：HPV 總感染率為28.43%，以HPV-16 型（6.97%）感染率最高，其次是HPV-52 型（6.83%）和HPV-58 型（5.01%），本研究發(fā)現(xiàn)深圳地區(qū)與廣州地區(qū)出現(xiàn)的常見(jiàn)感染型別一致，從我國(guó)健康人群HPV 病毒的篩查結(jié)果來(lái)看，高危型HPV 病毒中HPV-18 型并不是常見(jiàn)類(lèi)型，最為常見(jiàn)的類(lèi)型為HPV-16 型和HPV-52 型，其次是HPV-58 型［10］。但深圳地區(qū)感染率最高的型別為HPV-52 型，出現(xiàn)這一差異的原因可能是由于近幾年宮頸癌防治的宣傳教育加強(qiáng)了人們對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)，越來(lái)越多人選擇接種HPV 疫苗來(lái)預(yù)防宮頸癌的發(fā)生，而九價(jià)HPV 疫苗2018年底才在中國(guó)大陸上市，在此之前，大眾普遍接種的都是HPV 二價(jià)疫苗（預(yù)防HPV-16、HPV-18 型），因此HPV-16 型的感染得到一定程度控制，不再是感染率最高的型別。

從HPV 感染的年齡分布來(lái)看，感染率最高的是31～40 歲（39.23%），其次是61～80 歲（28.70%）和18 ～30 歲（26.01%）。31～40 歲女性處于性活躍階段，此階段感染HPV 的機(jī)會(huì)增加，因此這一年齡階段出現(xiàn)了HPV 感染的一個(gè)高峰。另一個(gè)HPV感染高峰年齡在60 歲以上，這部分女性絕大部分處于絕經(jīng)后，之前也有學(xué)者報(bào)道過(guò)在許多國(guó)家，HPV 感染的第二個(gè)高峰出現(xiàn)在絕經(jīng)后婦女中［11-12］，這與本研究結(jié)果一致。在絕經(jīng)期及絕經(jīng)后婦女中出現(xiàn)HPV 的流行有許多原因［13-14］，比如激素的生理性變化和生殖道環(huán)境的改變。有研究［15］報(bào)道由于激素的改變導(dǎo)致宮頸解剖學(xué)改變，因此使用宮頸細(xì)胞學(xué)作為老年女性宮頸癌篩查指標(biāo)的效果不甚理想。本研究通過(guò)將HPV 感染與宮頸細(xì)胞學(xué)結(jié)果結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)HPV 陽(yáng)性率與宮頸細(xì)胞病變程度存在線性關(guān)系。近期法國(guó)的一項(xiàng)研究指出對(duì)于絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女使用HPV 感染檢測(cè)進(jìn)行宮頸癌篩查的敏感性高于宮頸細(xì)胞學(xué)檢測(cè)［16］。RONCO 等［17］發(fā)現(xiàn)比起單獨(dú)應(yīng)用宮頸細(xì)胞學(xué)檢查，HPV感染檢測(cè)能更有效地篩查出宮頸高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變（CIN3）。因此，筆者認(rèn)為應(yīng)重視對(duì)絕經(jīng)期及絕經(jīng)后女性用HPV-DNA 分型檢測(cè)作為宮頸癌篩查的重要指標(biāo)，但絕經(jīng)期及絕經(jīng)后女性HPV感染的特征如感染的亞型、感染的持續(xù)性、危險(xiǎn)因素、病毒潛伏或復(fù)發(fā)的因素還有待深入研究。

此外，通過(guò)臨床資料的回歸分析還發(fā)現(xiàn)，初次性生活年齡是HPV 感染的危險(xiǎn)因素，筆者推測(cè)這與年輕女性性安全教育不足和對(duì)HPV 傳播認(rèn)識(shí)不足有關(guān)，來(lái)自成都的一份調(diào)查顯示被調(diào)查的女性中僅有29.94%曾了解過(guò)HPV 病毒［18］，人群對(duì)HPV普遍認(rèn)識(shí)不足，故應(yīng)加強(qiáng)青年女性性教育和HPV傳播的科普。此外，由于醫(yī)療資源緊張，由臨床醫(yī)生為患者采樣進(jìn)行HPV 大范圍篩查的流程較繁瑣，增加受檢者和醫(yī)生負(fù)擔(dān)。因此提高HPV 檢測(cè)的可行性，簡(jiǎn)化檢測(cè)方法，也值得進(jìn)一步嘗試和研究。目前已有自主采樣的試劑盒，可實(shí)現(xiàn)被檢測(cè)者自主采樣，為偏遠(yuǎn)地區(qū)人群的篩查提供便利，但其使用效果還有待觀察［19-20］。

本研究收集的進(jìn)行宮頸活檢的研究對(duì)象過(guò)少，對(duì)HPV 在宮頸病變中的影響研究意義有限，下一步還需要加強(qiáng)宮頸活檢對(duì)象的數(shù)據(jù)收集，進(jìn)一步研究HPV 感染與宮頸病變的關(guān)系，并就HPV 導(dǎo)致宮頸病變的機(jī)制進(jìn)行深入研究。中國(guó)地域廣袤，對(duì)不同地區(qū)HPV 感染率和感染亞型的分析對(duì)我國(guó)HPV 感染相關(guān)疾病的診治及疫苗的研發(fā)具有十分重要的意義。由于廣深地區(qū)是華南地區(qū)人口最密集的地方，也是沿海改革開(kāi)放的窗口，因此廣深地區(qū)可在一定程度上代表華南地區(qū)HPV 的流行情況，對(duì)這兩個(gè)地區(qū)連續(xù)進(jìn)行HPV 感染的分析將有助于華南地區(qū)HPV 感染防控策略的制定和疫苗的研發(fā)，對(duì)預(yù)防宮頸癌有十分重要的意義。