倪 明，吳高泉，何涓源，李煜林

(1.湖北師范大學 食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435002；2.湖北師范大學 生物學國家級實驗示范中心，湖北 黃石 435002；3.湖北師范大學 文理學院，湖北 黃石 435002 )

0 引言

側(cè)柏別名崖柏、香柏、松蟠，一般生長在石灰?guī)r山地或潮濕肥饒的地方，為中國特產(chǎn)，除青海、新疆外，中國各地均有種植。黃酮類化合物是一類普遍存在于植物界的次生代謝產(chǎn)物，其功效及成分來源尤為多樣[1]，藥物的毒副作用也少，并且擁有預(yù)防癌癥、消除自由基、降低血糖和抵抗炎癥等藥理活性[2]。目前，側(cè)柏葉的總黃酮提取工藝研究很多[3～5]，但與側(cè)柏果實總黃酮提取有關(guān)聯(lián)的研究文獻鮮見報道。為了更好地開發(fā)利用側(cè)柏，我們決定開展側(cè)柏果實黃酮提取工藝研究。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料 側(cè)柏果實摘自于湖北師范大學。

1.1.2 儀器設(shè)備 試驗室粉碎磨(JFSD-70型，上海嘉定糧油儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4型，金壇市醫(yī)療儀器廠)；電子分析天平(BSA124S型，賽多利斯科學儀器北京有限公司)；循環(huán)水式真空泵(SHZ-D型，鞏義市英峪予華儀器廠)；電熱恒溫干燥箱(SKG-02型，黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司)；冰箱(BCD-196KTX型，青島海爾股份有限公司)；紫外可見分光光度計(UV754N型，上海楚定分析儀器有限公司)。

1.1.3 試驗試劑 硝酸鋁(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；蘆丁標準品(上海金穗生物科技有限公司)；氫氧化鈉(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)；亞硝酸鈉(分析純，天津市天力化學試劑有限公司)；無水乙醇(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)；石油醚(60～90℃)(分析純，上海國藥試劑集團)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理 采集新鮮的側(cè)柏果實，蒸餾水清洗，自然風干后剪成細小碎塊，放入60℃烘箱中烘干并研磨，過60目篩之后再放入烘箱中烘干。將側(cè)柏果實干燥粉末裝入自制濾紙筒，密封后置于索氏提取器中，加入適量石油醚回流脫脂、脫色，直至提取管內(nèi)溶液無色為止。將脫色后的側(cè)柏果實粉末烘干至恒重后，置于干燥器中備用。

1.2.2 標準曲線的制作 蘆丁在烘箱120℃中烘至恒重，冷卻后精確稱取0.025 g，用濃度為95%的乙醇溶解所稱取蘆丁，充分溶解后將之轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中定容到刻度線，這樣就可以得到質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的蘆丁標準溶液。精密吸取蘆丁標準品溶液0、1、2、3、4、5、6 mL，分別加入7只25 mL比色管中，依次加入5%的NaNO2試劑1 mL，搖晃反應(yīng)6 min，依次加入10%的Al(NO3)3試劑1 mL，搖晃反應(yīng)6 min，依次加入10%的NaOH試劑10 mL，然后用95%的乙醇溶液定容到25 mL，充分搖晃，靜置15 min .以空白組作為對照，在504 nm處用紫外分光光度計測定各組吸光值(A)[6].

1.2.3 樣品總黃酮提取及含量的測定 稱取0.500 g預(yù)處理后的側(cè)柏果實粉置于50 mL圓底燒瓶中，在水浴鍋中使用乙醇溶液浸提，在一定溫度下水浴回流一段時間后，進行減壓抽濾，濾餅用適量乙醇溶液洗滌三次，合并濾液定容，得到樣液。

樣液測定總黃酮含量：取樣液1 mL置于25 mL比色管中，加5%的NaNO2試劑1 mL，搖勻反應(yīng)6 min，再加10%的Al(NO3)3試劑1 mL，搖勻反應(yīng)6 min，加10%的NaOH試劑10 mL，搖勻，用濃度為95%的乙醇試劑定容到25 mL，靜置15 min后，以空白試劑為對照，于504 nm用紫外分光光度計測定其吸光值，利用標準曲線方程得到總黃酮含量。然后即可計算總黃酮得率：

總黃酮得率 = (C×V)×100%/(M×1000)

式中：C——樣品液的質(zhì)量濃度(mg/mL)；

V——總提取液體積(mL)；

M——預(yù)處理后的側(cè)柏果實粉質(zhì)量(g).

1.2.4 側(cè)柏果實總黃酮提取的正交試驗設(shè)計 在預(yù)試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以總黃酮得率為最終評價標準，確定料液比(A)、乙醇體積分數(shù)(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)的提取最優(yōu)條件，每個因素確定三個水平進行正交試驗設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的制作

按照1.2.3的方法測出吸光度值后，以吸光度為縱坐標，以蘆丁含量(mg)為橫坐標，制圖(如圖1所示)，得到標準曲線方程：y=0.4896x-0.0004，R2= 0.9997.

圖1 標準曲線

2.2 側(cè)柏果實總黃酮提取的正交試驗結(jié)果及分析

根據(jù)預(yù)試驗，確定提取時間、乙醇體積分數(shù)、提取溫度和料液比的因素水平(見表1)，根據(jù)表1利用正交設(shè)計軟件設(shè)計正交試驗，通過試驗得到側(cè)柏果實總黃酮的得率(見表2)。

表1 側(cè)柏果實總黃酮提取的正交試驗因素水平設(shè)計表

由表2極差R分析可得到，這四種因素對側(cè)柏果實總黃酮得率的影響排序為：提取溫度>乙醇體積分數(shù)>提取時間>料液比。由表2可得理論最優(yōu)組合為A3B2C3D3，對該理論最優(yōu)組合進行驗證試驗，得到的得率10.71%，結(jié)果表明這個條件下得率最高。為了驗證試驗重復(fù)性，在最佳提取條件下，反復(fù)進行三次驗證試驗，依次得到側(cè)柏果實黃總酮得率為10.43%、10.31%、10.18%，從而得出側(cè)柏果實總黃酮的平均得率為10.30%.

表2 側(cè)柏果實總黃酮提取工藝正交試驗表

3 結(jié)論

本試驗以乙醇溶液為溶劑，以側(cè)柏果實總黃酮得率為考察對象，通過對溫度、料液比、時間和乙醇體積分數(shù)進行單因素試驗和正交試驗，得到側(cè)柏果實總黃酮最佳提取工藝為：料液比為1∶70，乙醇體積分數(shù)為60%，提取溫度為100℃，提取時間為8 h，在此條件下得率達到10.71%.