王丹妮，張 宸，高賢嫻，洪 鐵,2*，王小龍

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，長春130021；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春130012；3.吉林省婦幼保健院，長春130061）

膀胱過度活動癥（Overactive Bladder，OAB）是一種以尿急為主要特征的伴有尿頻、夜尿、可伴或不伴急迫性尿失禁的臨床常見泌尿系統(tǒng)疾病。在尿流動力學(xué)上可表現(xiàn)為膀胱逼尿肌過度活動，也可為其它形式的尿道與膀胱功能障礙。引起膀胱過度活動的主要原因為膀胱出口梗阻（Bladder outlet obstruction，BOO），即膀胱頸和/或尿道由于多種原因引起的尿道縮窄導(dǎo)致排尿困難。目前還未能發(fā)現(xiàn)針對性治療膀胱過度活動癥的藥物及療法，多以改善癥狀為主。穩(wěn)尿膠囊是吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院泌尿外科專家以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)根據(jù)長期臨床實踐總結(jié)出的經(jīng)驗方，對機(jī)體的泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)具有較好的調(diào)節(jié)作用，可用于治療具有膀胱過度活動癥狀的泌尿系統(tǒng)疾病。在具有膀胱出口梗阻病變的一類疾病中，梗阻的發(fā)生部位絕大部分位于膀胱頸及近端尿道，例如男性良性前列腺增生癥、女性產(chǎn)后膀胱頸梗阻等。因此本研究選用結(jié)扎膀胱-近端尿道連接處的大鼠膀胱出口梗阻模型模擬人類膀胱過度活動癥以研究穩(wěn)尿膠囊對膀胱過度活動癥的治療作用。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF級SD 大鼠，雌性，60只，體質(zhì)量220～240g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，將動物于動物室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，溫度為20～24℃，濕度為40%～70%，12h明暗交替照明，給予維持飼料，自由飲水。

1.2 實驗試劑

酒石酸托特羅定片由山東魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn)；大鼠神經(jīng)生長因子（NGF）ELISA試劑盒由武漢默沙克生物科技有限公司生產(chǎn)；大鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供；丙二醛（MDA）測定試劑盒（TBA法）、總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（WST-1法）由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 實驗儀器

BL-420E+生物機(jī)能實驗系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；科耐普計量智能型恒流泵，重慶科耐普蠕動泵有限公司；全波長酶標(biāo)儀，Biotek公司；手持式高速勻漿機(jī)，上海巴玖實業(yè)有限公司；BS124S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；3-18k低溫高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；XPX-9052 MBE數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 動物模型的建立與分組給藥

將60只SD雌性大鼠，按體重隨機(jī)分為6組，正常對照組6只，膀胱梗阻模型（BOO）組14只，其余各給藥組各10只，分別為穩(wěn)尿膠囊高劑量組（5.4mg/kg），穩(wěn)尿膠囊中劑量組（2.7mg/kg），穩(wěn)尿膠囊低劑量組（1.35mg/kg），陽性對照托特羅定片（0.5mg/kg）組。大鼠分籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食飲水。

大鼠行膀胱梗阻手術(shù)模擬大鼠膀胱過度活動癥。腹腔注射10%水合氯醛 （0.3ml/100g）對大鼠進(jìn)行麻醉，麻醉成功后仰臥位固定大鼠于動物手術(shù)臺，消毒腹部及會陰部，取硬膜外麻醉導(dǎo)管自制導(dǎo)尿管經(jīng)尿道插入膀胱并固定，用以支撐尿道。沿骨盆趾骨上緣做下腹部正中切口，逐層剪開皮膚、腹直肌層及腹膜，推開覆蓋的子宮和附著的脂肪，顯露膀胱，沿膀胱向下，稍分離筋膜顯露膀胱頸及近端尿道，手術(shù)彎針帶4-0絲線穿過膀胱頸周圍韌帶，在靠近膀胱頸-近端尿道處進(jìn)行結(jié)扎，絲線結(jié)扎力度以能滑動尿道中導(dǎo)管并帶動周圍組織為度。以上操作均為同一術(shù)者實施。假手術(shù)組采用相同術(shù)式但不做結(jié)扎處理，其余操作相同。結(jié)扎后移除導(dǎo)尿管，逐層縫合下腹部切口，局部用碘伏消毒后，腹腔內(nèi)注射青霉素80萬U/只，大鼠保持體溫，完全復(fù)蘇后放回籠中。術(shù)后3天大鼠給予同等劑量青霉素抗感染，早晚各一次，并觀察大鼠下腹部傷口和排出尿液情況。術(shù)后第4天開始給藥，給藥組按組別灌胃給予不同濃度受試藥，每日1次連續(xù)6周，假手術(shù)組及BOO組灌胃給予同等體積蒸餾水。

2.2 觀測指標(biāo)

2.2.1 大鼠一般狀態(tài)

實驗期間觀察大鼠一般狀態(tài)，包括體重、排尿情況、毛發(fā)、精神狀態(tài)等。

2.2.2 大鼠尿流動力學(xué)指標(biāo)測定

末次給藥2h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰臥位固定大鼠，消毒腹部及會陰部，沿腹部原創(chuàng)口位置做一切口，完全暴露膀胱，將膀胱頸周圍脂肪、增生組織分離，將膀胱口-近端尿道結(jié)扎線拆除，經(jīng)尿道口插入導(dǎo)尿管導(dǎo)出膀胱內(nèi)尿液。用鑷子輕提膀胱頂端，眼科剪在頂端做一小孔，將兩根PE-50軟管（內(nèi)徑0.58mm外徑0.96mm）經(jīng)小孔插入膀胱內(nèi)部約5mm深，固定軟管，軟管1連接壓力換能器后連接BL-420E+生物機(jī)能實驗系統(tǒng)，軟管2連接蠕動泵，排凈系統(tǒng)內(nèi)殘留空氣后調(diào)零，輕壓膀胱排出多余尿液，將此時的膀胱壓力調(diào)至基線。系統(tǒng)穩(wěn)定后，膀胱灌注溫生理鹽水（灌注速度為0.1ml/min），看見有尿液流出立即停止灌注，記錄尿流動力學(xué)波形圖及排尿點壓PT（mmHg）、排尿壓峰值 MP（mmHg）。至少記錄 3 個排尿周期。

收集排出尿液稱量體積UV（ml），測定結(jié)束時導(dǎo)尿管連接注射器將膀胱中殘余尿液吸出，記錄剩余尿量 RV（ml），計算膀胱容量 TUV（ml）:

TUV(ml)=UV(ml)+RV(ml)

實驗結(jié)束后取大鼠膀胱組織，稱重記錄膀胱濕重（mg），計算膀胱指數(shù)：

膀胱指數(shù) （%）=膀胱濕重 （mg）/大鼠體重（g）x100%

2.2.3 大鼠尿液中NGF含量測定

大鼠尿液靜置1h后離心分離上清，離心條件4℃下，4000r/min，10 min，-80℃凍存?zhèn)溆?。采?ELISA 法嚴(yán)格按照說明書的指導(dǎo)測定大鼠尿液中神經(jīng)生長因子NGF的含量變化。

2.2.4 大鼠膀胱組織中SOD、MDA、IL-1β的含量測定

取大鼠膀胱組織，液氮速凍后轉(zhuǎn)-80℃凍存?zhèn)溆?。取適量膀胱組織，加入冰生理鹽水，置于冰浴中用組織勻漿器制成膀胱組織勻漿，離心取上清液，離心條件4℃下，3500 r/min，10 min。 取適量上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書的要求測定膀胱組織上清液中IL-1β含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的要求測定膀胱組織上清液中SOD、MDA含量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

全部實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行。根據(jù)檢驗數(shù)據(jù)資料的正態(tài)性和方差齊性，各組數(shù)據(jù)均用x±s表示，組間比較采用t檢驗比較差異的顯著性。P＜0.05即有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀況及膀胱形態(tài)變化

建立模型早期大鼠進(jìn)食量稍減，體重稍減，后期恢復(fù)正常。實驗結(jié)束后觀察各組大鼠膀胱形態(tài)，假手術(shù)組膀胱大小正常，表面略粉色，觸之有彈性；BOO組膀胱明顯增大，表面被膜充血，顏色較深，觸之較硬，膀胱壁明顯增厚，留存尿液增多。其余各給藥組膀胱形態(tài)有不同程度恢復(fù)。

（上圖為膀胱出口梗阻大鼠膀胱形態(tài)變化示意圖）

3.2 大鼠尿流動力學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果

假手術(shù)組大鼠膀胱充盈期呈低壓狀態(tài)，排尿期膀胱壓升高隨排尿活動進(jìn)行而逐漸降低，具有規(guī)律的尿流動力學(xué)波形；與假手術(shù)組相比，BOO組大鼠膀胱充盈期出現(xiàn)逼尿肌不穩(wěn)定收縮，收縮頻率明顯增高，形成不規(guī)則的鋸齒狀圖形；與BOO組相比各濃度給藥組波形有不同程度的改善，其中穩(wěn)尿膠囊高劑量組與陽性藥組更接近于假手術(shù)組尿流動力學(xué)波形，詳見圖1。與假手術(shù)組相比，BOO組大鼠排尿點壓力MP升高、排尿壓峰值PT升高、膀胱剩余尿量RV增多、排除尿量UV減少、膀胱容量TUV減?。ㄎ戳谐觯?、膀胱濕重增加（未列出）、膀胱指數(shù)升高，均有顯著性差異（P＜0.01）；與BOO組相比，穩(wěn)尿膠囊高劑量組和陽性對照組可降低PT、MP，使RV減少UV增加，降低膀胱重量及膀胱指數(shù)，均具有顯著性差異（P＜0.01）。尿流動力學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果見表1。

圖1 穩(wěn)尿膠囊對BOO大鼠尿流動力學(xué)影響結(jié)果

表1 穩(wěn)尿膠囊對BOO大鼠尿流動力學(xué)指標(biāo)及膀胱指數(shù)的影響結(jié)果（x±s）

3.3 大鼠體內(nèi)NGF、SOD、MDA、IL-1β含量測定結(jié)果

與假手術(shù)組相比，BOO組大鼠尿液NGF含量顯著增加（P＜0.01），膀胱組織上清液中 MDA、IL-1β 含量增加 （P＜0.05，P＜0.01），SOD 含量顯著減少 （P＜0.01）；與BOO組相比，穩(wěn)尿膠囊高劑量組和陽性對照組大鼠尿液NGF含量顯著降低，膀胱組織上清液中 MDA、IL-1β 含量降低（P＜0.01，P＜0.05），SOD 含量顯著升高（P＜0.01），結(jié)果見表 2。

表2 穩(wěn)尿膠囊對BOO大鼠大鼠體內(nèi)各因子含量的測定結(jié)果（x±s）

4 討論

膀胱過度活動癥（overactive bladder，OAB）是由膀胱逼尿肌的過度活動引起的以尿頻、尿急、尿不盡為主要癥狀的的常見泌尿外科疾病，引起OAB的原因多為下尿路梗阻、膀胱持續(xù)處于刺激狀態(tài)及膀胱-尿道炎癥等[1]。OAB患者膀胱逼尿肌的過度活動會導(dǎo)致膀胱頻繁無規(guī)律性收縮，使膀胱喪失儲尿功能，頻繁引起尿意，并且可隨著患病時間增長而引起其他尿道—膀胱功能障礙，提示下尿路梗阻是引起逼尿肌不穩(wěn)定的主要原因。膀胱出口梗阻 (Bladder outlet obstruction，BOO)可引起膀胱組織結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為膀胱增大肥厚失去彈性使順應(yīng)性降低，導(dǎo)致排尿期壓力降低，使尿液潴留而導(dǎo)致下尿路梗阻和膀胱持續(xù)刺激癥狀。本文采用大鼠BOO模型模擬梗阻后膀胱的異常變化，常用于模擬人類OAB膀胱病變過程。

尿液中神經(jīng)生長因子 （nerve growth factor，NGF）的含量測定是近年來臨床研究最多的無創(chuàng)診斷OAB的方法，有望替代尿流動力學(xué)監(jiān)測以快速診斷OAB。已有許多研究顯示NGF直接參與OAB發(fā)病過程及癥狀表現(xiàn)[2]。尿液NGF主要由膀胱上皮細(xì)胞表達(dá)。許多研究表明OAB患者尿液中NGF表達(dá)升高[3～4]，在膀胱平滑肌和黏膜組織中分泌明顯增加[5]。本實驗中大鼠尿液NGF的表達(dá)升高提示膀胱處于過度活動狀態(tài)，可作為判斷實驗性O(shè)AB模型成功的指標(biāo)。白細(xì)胞介素-1β是常見的致炎因子，已有研究表明膀胱炎癥反應(yīng)和IL-1β是BOO引起膀胱逼尿肌過度活動的核心通路，已被證實IL-1β可直接刺激膀胱逼尿肌，介導(dǎo)膀胱炎癥反應(yīng)[6]。BOO發(fā)生后膀胱會進(jìn)行周期性缺血-再灌注，產(chǎn)生很多氧化應(yīng)激因子造成膀胱黏膜損傷，這些氧化應(yīng)激因子可與脂質(zhì)反應(yīng)生成大量過氧化產(chǎn)物丙二醛附著于膀胱黏膜表面使粘膜通透性增加。超氧化物歧化酶是抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，可清除氧自由基，調(diào)節(jié)膀胱內(nèi)氧化應(yīng)激因子含量，降低BOO引起的膀胱缺血-再灌注損傷。已有研究證實兔膀胱發(fā)生BOO后，膀胱MDA含量增加、SOD活性降低[7]。

穩(wěn)尿膠囊是根據(jù)多年治療OAB及具有BOO癥狀的泌尿道疾病的臨床經(jīng)驗而總結(jié)出的經(jīng)驗方，具有利尿排毒、益氣固本的作用。組方中的君藥黃芪作為利水藥材多用于治療膀胱過度活動癥[8]，具有補(bǔ)氣固表，托毒排膿，利尿生肌的作用，也常用來治療自汗水腫、慢性腎炎蛋白尿、糖尿病等疾病。已有研究表明，黃芪可改善逼尿肌不穩(wěn)定大鼠下尿路癥狀[9]，抑制體外膀胱逼尿肌收縮頻率和張力[10]。綜上，穩(wěn)尿膠囊可能通過改善尿流動力學(xué)、抑制NGF表達(dá)、抑制膀胱炎癥及氧化-應(yīng)激反應(yīng)等治療膀胱過度活動癥，其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。