魏濤 陳順心 黃申 錢玉梅 趙彩夢 毛多斌

關鍵詞：β-胡蘿卜素;發(fā)酵條件;香味成分;再造煙葉濃縮液

摘要：運用單因素試驗和正交試驗，對β-胡蘿卜素降解菌株HC-3的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，并將最佳發(fā)酵條件下得到的菌株HC-3發(fā)酵液應用于再造煙葉濃縮液中以研究其增香效果.結果表明：菌株HC-3發(fā)酵降解β-胡蘿卜素的最佳條件為NaNO3質量濃度3 g/L，蔗糖質量濃度30 g/L，酵母粉質量濃度 3 g/L，初始pH值7.0，在該發(fā)酵條件下β-胡蘿卜素降解率可達93.35%.經菌株HC-3處理后，再造煙葉濃縮液中的二氫獼猴桃內酯、4，7，9-巨豆三烯-3-酮、4-羥基-β-二氫大馬酮、9-羥基-4，7-巨豆三烯酮、檸檬酸三乙酯、4-（3-羥基丁基）-3，5，5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮、肉豆蔻酸和新植二烯這8種香味成分含量明顯提高;與未經處理的再造煙葉濃縮液相比，利用菌株HC-3處理后的再造煙葉濃縮液制得的片基香氣質較好、香氣量較足、香氣濃度較高、雜氣量較低.

Abstract：The fermentation conditions of β-carotene degrading strain HC-3 were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment，and the fermentation liquid of strain HC-3 obtained under the optimal fermentation conditions was applied to the reconstituted tobacco concentrate to study its aroma enhancing effect.The results showed that the best fermentation conditions for β-carotene degradation were 3 g/L of NaNO3，30 g/L of sucrose，3 g/L of yeast powder and 7.0 of initial pH value.Under this condition，the degradation rate of β-carotene could reach 93.35%.After being treated by strain HC-3，the? eight flavor components of dihydroactyl lactone， 4，7，9-Mega three ene -3- keton， 4- hydroxyl -β-two hydrogen damascene，9-hydroxy-4，7-Mega three ene ketene，triethyl citrate， 4- （3-hydroxyl butyl） -3，5，5- three methyl -2- cyclohexene -1- ketone，tetradecanoic acid? and neophytadiene in the reconstituted tobacco concentrate were significantly increased.Compared with the untreated reconstituted tobacco concentrate，

0 引言

類胡蘿卜素屬于質體色素，一般存在于葉綠體結構內部，由8個異戊二烯殘基單位構成，是含40個碳原子的萜烯化合物的總稱[1-2].作為一種非常重要的天然色素，類胡蘿卜素普遍存在于水果（如檸檬、葡萄、菠蘿、橙子、草莓等）、蔬菜（如西紅柿、紅辣椒、胡蘿卜等）、鮮花（如花菱草、萬壽菊、水仙花等）、部分海洋動物、微生物和昆蟲體內，類胡蘿卜素也是一種重要的香味前體物質[3-4].依據(jù)分子兩端化學結構的不同，類胡蘿卜素可分為β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、δ-胡蘿卜素、ε-胡蘿卜素和其他異構體.在煙葉調制、陳化和加工過程中，類胡蘿卜素持續(xù)的降解作用不但可以提升煙葉中性香味物質的總量，所形成的產物還可進一步經氧化、還原、脫水等化學變化產生更多重要的煙草香味成分[5-6].類胡蘿卜素經氧化作用，可分別在C9—C10，C11—C13，C13—C15等雙鍵位置發(fā)生斷裂[7-10]，生成一系列重要的煙草香味成分，如二氫大馬酮、大馬酮、二氫彌猴桃內酯、紫羅蘭酮、環(huán)檸檬醛、氧代異氟爾酮等[11-13].

再造煙葉是利用煙草加工過程中產生的煙草廢棄物（煙末、碎煙片、片煙、煙梗等），經過重新加工組合而成的煙葉替代物.其主要加工過程包括煙草原料預處理、水萃取、濃縮、制漿、抄造、涂布、干燥、后處理等.在再造煙葉生產過程中，煙草提取濃縮液的作用是為涂布工序提供香氣量充足且質量穩(wěn)定、性能均一的涂布液，而涂布液的品質又直接決定了再造煙葉產品的內在品質[14-16].目前普遍采用物理方法與化學方法制備煙草濃縮液，但存在香味物質含量低、種類少、副產物較多等問題，而采用微生物技術制備煙草濃縮液，具有轉化率高、專一性高、香味物質品質高等優(yōu)勢，因而成為提升再造煙葉濃縮液及其制品品質的重要方法之一.此前有人報道過β-胡蘿卜素降解產香菌株，但降解率較低，一般在80%以下[7-8]，也未見β-胡蘿卜素降解菌應用于再造煙葉濃縮液的相關報道.

魏濤等[17]從再造煙葉濃縮液中篩選到一株β-胡蘿卜素降解產香菌株，為大腸桿菌 HC-3，初步發(fā)現(xiàn)其對于β-胡蘿卜素具有較好的降解效果.在此基礎上，本文擬研究β-胡蘿卜素降解菌株HC-3的最佳發(fā)酵條件，以獲得β-胡蘿卜素的最優(yōu)降解率，并進一步對該菌株發(fā)酵液應用于再造煙葉濃縮液的增香效果進行研究，以期解決再造煙葉濃縮液品質較低、利用率較低等相關技術問題.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

大腸桿菌（Enterobacter sp.）HC-3，由鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院實驗室篩選與保存;β-胡蘿卜素標樣，購于百靈威科技有限公司;β-胡蘿卜素（純度95%），購于陜西帕尼爾生物科技有限公司.

碳源：蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖和果糖;氮源：NaNO3，（NH4）2SO4，胰蛋白胨和尿素;酵母粉;以上試劑均為分析純，購于生工生物工程（上海）股份有限公司.

再造煙葉濃縮液TS-01，由河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司提供.

1.1.2 主要培養(yǎng)基

無碳源培養(yǎng)基：K2HPO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，NaNO3 3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，β-胡蘿卜素15 mg/L.

無碳源無氮源培養(yǎng)基：K2HPO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，β-胡蘿卜素15 mg/L.

1.1.3 主要儀器

7890C GC-MS色譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司產;2600 UC/VIS紫外可見分光光度計，美國UNIC公司產.

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素試驗

1.2.1.1 碳源對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響分析方法 選取無碳源培養(yǎng)基，分別添加蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖和果糖作為碳源，調整初始pH值為7.0，滅菌制得發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度30 ℃條件下，搖床150 r/min培養(yǎng)24 h，通過比較不同碳源下菌株細胞干重和β-胡蘿卜素降解率，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源.將該最佳碳源分別以質量濃度10 g/L，30 g/L，50 g/L，70 g/L和90 g/L添加至發(fā)酵培養(yǎng)基，在前述條件下對菌株HC-3進行培養(yǎng)，確定其適宜質量濃度.

1.2.1.2 氮源對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響分析方法 選取無碳源無氮源培養(yǎng)基，在最佳碳源及其最佳質量濃度的條件下，分別添加NaNO3，（NH4）2SO4，胰蛋白胨和尿素作為氮源，調整初始pH值為7.0，滅菌制得發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度30 ℃條件下，搖床 150 r/min 培養(yǎng)24 h，通過比較不同氮源下菌株細胞干重和β-胡蘿卜素降解率，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源.將該最佳氮源分別以質量濃度1 g/L，3 g/L，5 g/L，7 g/L和 9 g/L 添加至發(fā)酵培養(yǎng)基，在前述條件下對菌株HC-3進行培養(yǎng)，確定其適宜質量濃度.

1.2.1.3? 酵母粉質量濃度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響分析方法 選取無碳源無氮源培養(yǎng)基，在最佳碳源、氮源及其最佳質量濃度的條件下，調整初始pH值為7.0，滅菌制得發(fā)酵培養(yǎng)基，將酵母粉分別以質量濃度1 g/L，3 g/L，5 g/L，7 g/L和9 g/L添加至發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度30 ℃，搖床150 r/min條件下，對菌株HC-3培養(yǎng) 24 h，比較β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重，確定其適宜質量濃度.

1.2.1.4 初始pH值對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響分析方法 選取無碳源無氮源培養(yǎng)基，添加最佳質量濃度的碳源、氮源和酵母粉，分別調整初始pH值至5.0，6.0，7.0，8.0和9.0，滅菌制得發(fā)酵培養(yǎng)基.在溫度30 ℃，搖床 150 r/min條件下，對菌株HC-3培養(yǎng)24 h，比較β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重，確定適宜初始pH值.

1.2.1.5 培養(yǎng)溫度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響分析方法 選取無碳源無氮源培養(yǎng)基，添加最佳質量濃度的碳源、氮源和酵母粉，調整至最佳初始pH值，滅菌制得發(fā)酵培養(yǎng)基，分別于20 ℃，25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃和45 ℃條件下，搖床150 r/min對菌株HC-3培養(yǎng)24 h，通過比較β-胡蘿卜素的降解率和菌株細胞干重，確定適宜培養(yǎng)溫度.

1.2.2 正交試驗

以單因素試驗結果為基礎，選取4個影響較大的因素設計L9（34）正交試驗，以確定菌株HC-3的最佳發(fā)酵條件.

1.2.3 煙支樣品的制備

將最佳發(fā)酵條件下所得菌株HC-3發(fā)酵液和再造煙葉濃縮液TS-01按1GA6FA100的體積比混合處理，在溫度為30 ℃，pH值為6.0條件下，搖床150 r/min處理72 h.

將菌株HC-3發(fā)酵液處理前和處理后的再造煙葉濃縮液按39%涂布率分別涂布至相應片基上，在90 ℃條件下烘10 min，回潮至水分含量12.5%后切絲卷制成煙支，再將相應煙支在溫度（22±2） ℃，相對濕度（ 60 ± 5）%的恒溫恒濕箱中平衡 48 h[18].

1.2.4 β-胡蘿卜素降解率和香味物質含量的測定方法

采用分光光度計方法測定β-胡蘿卜素的降解率，具體方法參見文獻[19].采用GC-MS分析方法檢測再造煙葉濃縮液中香味物質的含量，具體方法參見文獻[17].

1.2.5 感官評價方法

采用文獻[20]中的方法對1.2.3制備的煙支樣品進行感官評價，以實際評吸結果來檢驗菌株HC-3發(fā)酵液對再造煙葉濃縮液處理后產生的效果.評價小組由15位評委組成.

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 碳源對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響

碳源對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響如圖1所示.由圖1可知，菌株HC-3利用碳源的能力依次為：蔗糖>乳糖>麥芽糖>果糖>葡萄糖，且菌株HC-3利用蔗糖的能力明顯優(yōu)于其他碳源，β-胡蘿卜素降解率達到87.5%，菌株細胞干重達到39.2 g/L.這可能是因為蔗糖是一種非還原性雙糖，可以被菌株緩慢吸收，為其生長提供必要的碳源和能量，并確保其可以完全降解底物β-胡蘿卜素.而葡萄糖是還原性單糖，雖然其可被菌株快速吸收，但會導致菌株對β-胡蘿卜素的降解率降低.乳糖和麥芽糖因不易水解故不易被該菌株利用.

在確定最佳碳源為蔗糖后，繼續(xù)研究蔗糖質量濃度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響，結果如圖2所示.由圖2可知，當蔗糖質量濃度小于30 g/L時，菌株對β-胡蘿卜素的降解率較高;當蔗糖質量濃度大于30 g/L時，菌株對β-胡蘿卜素的降解率開始緩慢降低.這可能是因為當蔗糖質量濃度高于30 g/L 時，菌株優(yōu)先利用過量的蔗糖，導致β-胡蘿卜素不能很好地被降解;當蔗糖質量濃度為 30 g/L 時，菌株可以正常生長并完全降解底物.因此，選擇碳源蔗糖的最佳質量濃度為 30 g/L.

2.1.2 氮源對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響

氮源對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響如圖3所示.由圖3可知，菌株HC-3在氮源為NaNO3的培養(yǎng)基中對β-胡蘿卜素降解率最高，達86.1%，同時菌株細胞干重達到39.8 g/L.在確定最佳氮源為NaNO3后，繼續(xù)研究NaNO3質量濃度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響，結果如圖4所示.由圖4可知，當NaNO3質量濃度低于3 g/L 時，該菌株對β-胡蘿卜素的降解率隨著NaNO3質量濃度的增加而升高;當NaNO3質量濃度為 3 g/L 時，該菌株對β-胡蘿卜素的降解率最高;當NaNO3質量濃度高于3 g/L 時，該菌株對β-胡蘿卜素的降解率呈下降趨勢.這可能是因為氮源過多，會使菌體生長過于旺盛，pH升高，代謝產物積累困難.因此，選擇氮源NaNO3的最佳質量濃度為3 g/L.

2.1.3 酵母粉質量濃度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響

酵母粉質量濃度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響如圖5所示.由圖5可知，酵母粉對β-胡蘿卜素降解速率的影響非常明顯，當酵母粉質量濃度低于3 g/L 時，菌株對β-胡蘿卜素的降解能力最高;之后，降解率隨著酵母粉質量濃度的增加而顯著下降;當酵母粉質量濃度為 9 g/L時，菌株生長最好，但是對底物的降解能力最低.因此，選擇酵母粉的最佳質量濃度為3 g/L.

2.1.4 初始pH值對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響

微生物機體內的反應一般都是酶促反應，而酶促反應都會有一個最適的pH值范圍.初始pH值對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響如圖6所示.由圖6可知，發(fā)酵液的初始pH值對β-胡蘿卜素降解率影響極大，在初始pH值小于7.0時，菌株HC-3對β-胡蘿卜素的降解能力隨pH值的增大而增大;當初始pH值大于7.0時，菌株HC-3對β-胡蘿卜素的降解率緩慢下降.因此，選擇最佳初始pH值為7.0.

2.1.5 培養(yǎng)溫度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響

微生物不同的生理活動均要求相應的溫度，溫度不僅影響酶活還能夠影響酶促反應速率.培養(yǎng)溫度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細胞干重的影響如圖7所示.由圖7可知，溫度在35 ℃ 時，降解率達到最高，菌株細胞干重較高，因此，選擇最適培養(yǎng)溫度為35 ℃.

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選取4個影響較大的因素，即蔗糖質量濃度（A）、NaNO3質量濃度（B）、酵母粉質量濃度（C）和初始pH值（D），設計L9（34）正交試驗，正交試驗因素水平如表1所示，正交試驗結果如表2所示.由表2可知，影響β-胡蘿卜素降解率的因素主次為C>B>A>D，即酵母粉質量濃度>NaNO3質量濃度>蔗糖質量濃度>初始pH值.降解率方差分析結果如表3所示.由表3可知，酵母粉質量濃度對β-胡蘿卜素降解率影響顯著.菌株 HC-3的最佳發(fā)酵條件為A3B2C2D1，即蔗糖質量濃度30 g/L，NaNO3質量濃度3 g/L，酵母粉質量濃度3 g/L，初始pH值7.0.經驗證，在此最佳發(fā)酵條件下，菌株HC-3對β-胡蘿卜素的降解率為93.35%.

2.3 再造煙葉濃縮液處理前后的香味成分分析

以菌株HC-3處理前的再造煙葉濃縮液為對照組、菌株HC-3處理后的再造煙葉濃縮液為實驗組，菌株HC-3處理前后再造煙葉濃縮液香味成分的變化如表4所示.由表4可知，菌株HC-3處理前后再造煙葉濃縮液中共有46種香味成分發(fā)生變化，其中8種主要香味成分含量明顯提高，分別為二氫獼猴桃內酯（提高0.616%）、4，7，9-巨豆三烯-3-酮（提高 0.765%）、4-羥基-β-二氫大馬酮（提高 0.933%）、9-羥基-4，7-巨豆三烯酮（提高 2.730%）、檸檬酸三乙酯（提高0.535%）、4-（3-羥基丁基）-3，5，5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮（提高0.071%）、肉豆蔻酸（提高0.517%）和新植二烯（提高9.177%）.

2.4 感官評吸結果

再造煙葉濃縮液處理前后的評吸效果如表5所示.由表5可知，與未處理的再造煙葉濃縮液相比，經菌株HC-3處理后的再造煙葉濃縮液綜合得分提高0.7分，所得片基香氣質較好、香氣量較足、香氣濃度較高、雜氣量較低.

3 結論

本文運用單因素試驗和正交試驗，對β-胡蘿卜素降解菌株HC-3的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，并將最佳發(fā)酵條件下得到的菌株HC-3發(fā)酵液應用于再造煙葉濃縮液，結合感官評吸考察該菌株的增香效果.結果表明：菌株HC-3發(fā)酵降解β-胡蘿卜素的最佳條件為NaNO3質量濃度3 g/L，蔗糖質量濃度30 g/L，酵母粉質量濃度3 g/L，初始pH值7.0，在該發(fā)酵條件下β-胡蘿卜素降解率可以達到93.35%.經該菌株處理后，再造煙葉濃縮液中的二氫獼猴桃內酯、4，7，9-巨豆三烯-3-酮、4-羥基-β-二氫大馬酮、9-羥基-4，7-巨豆三烯酮、檸檬酸三乙酯、4-（3-羥基丁基）-3，5，5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮、肉豆蔻酸和新植二烯這8種香味成分含量明顯提高;與未處理再造煙葉濃縮液相比，經菌株HC-3處理后的再造煙葉濃縮液制得的片基香氣質較好、香氣量較足、香氣濃度較高、雜氣量較低，綜合得分提高了0.7分.該β-胡蘿卜素降解產生致香物質的新技術有助于提高再造煙葉濃縮液品質和利用率，也為我國再造煙葉生物增香提供了一種新的途徑和方法.

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