趙森銘，孟亞磊，韓慧麗，雷高明，張志超，方藝霖

(1.洛陽市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室， 河南 洛陽 471023； 2.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，河南 洛陽 471003； 3.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，河南 洛陽 471023； 4.洛陽市食品藥品檢驗(yàn)所食品檢驗(yàn)室，河南 洛陽 471023； 5.四川省樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，四川 樂山 614000)

鐵皮石斛屬蘭科植物，是一種傳統(tǒng)名貴藥材，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，可用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、陰虛火旺、骨蒸癆熱、目暗不明、筋骨萎軟等病癥，還具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)人體免疫力等功效[1-5]；因鐵皮石斛喜溫暖濕潤的氣候和陰暗潮濕的環(huán)境，特別是高溫高濕季節(jié)，極易受到病蟲害的侵害，故在鐵皮石斛的種植過程中，會(huì)使用到大量的農(nóng)藥用于祛除病蟲害的影響；三唑類農(nóng)藥是一類高效低毒、內(nèi)吸性殺菌劑，除抑菌作用外，還對植物具有調(diào)節(jié)生理效能等作用[6-8]，因此該類農(nóng)藥應(yīng)用極為廣泛；蔬果中有關(guān)三唑類農(nóng)藥的檢測文獻(xiàn)也有報(bào)道[9-17]。鐵皮石斛于2018年被國家衛(wèi)計(jì)委列入食藥同源名錄，因此鐵皮石斛在食品、藥品領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛，為保障廣大人民群眾的飲食、用藥安全，本文參照2015年版《中國藥典》四部通則農(nóng)藥殘留量測定法[18-19]，研究三唑酮、三唑醇、戊唑醇、腈苯唑和烯唑醇質(zhì)譜條件，并進(jìn)行了優(yōu)化，建立了固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜法(SPE-GC-MS/MS)法檢測種植環(huán)節(jié)鐵皮石斛中5種三唑類農(nóng)藥殘留量的分析方法，結(jié)果表明，此方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可以用于鐵皮石斛中三唑類農(nóng)藥殘留的監(jiān)測。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SHIMADZU GC-2010Plus氣相色譜儀(日本島津科技有限公司)；SHIMADZU TQ-8040質(zhì)譜儀(日本島津科技有限公司)；Aglient DB-5 MS石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司)；梅特勒 XS-204 DR電子天平(瑞士梅特勒科技有限公司)；SPE-DEX4790型全自動(dòng)固相萃取儀(美國horizon科技公司)；Milli-Q Integral 型超純水儀(美國密理博科技公司)；DSY-VI型氮吹儀(北京東方精華苑)；Allegra X-15R型高速冷凍離心機(jī)(美國貝克曼科技公司)；IKA T10均質(zhì)機(jī)(廣州艾卡科技公司)。

1.2 試藥

三唑酮、三唑醇、戊唑醇、腈苯唑和烯唑醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度：100 μg/mL，批號依次為：GBW(E)083199，GBW(E)083197，GBW(E)083263，GBW(E)081722和GBW(E)083198，均購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測保護(hù)研究所)；Waters Oasis?HLB固相萃取小柱(美國沃特世科技公司)；甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯均為色譜純(美國TEDIA公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Aglient DB-5 MS石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：高純氦氣；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；檢測器溫度：260 ℃；載氣流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣量：1.0 μL。升溫程序見表1。

表1 GC升溫程序Table 1 GC temperature rising program

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：EI源；離子源溫度：240 ℃；轟擊能量：65 eV；接口溫度：270 ℃；碰撞氣：高純氬氣；溶劑延遲時(shí)間：3.5 min；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；質(zhì)譜參數(shù)如下表2：

2.3 溶液配制

2.3.1 混合儲備標(biāo)準(zhǔn)溶液 取三唑酮、三唑醇、戊唑醇、腈苯唑和烯唑醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密移取各1.0 mL，置于同一個(gè)10 mL量瓶中，加丙酮定容至刻度，搖勻，即得三唑酮、三唑醇、戊唑醇、腈苯唑和烯唑醇質(zhì)量濃度均為10.0 μg/mL的混合儲備標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表2 5種三唑類農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrum parameters of 5 triazole pesticides

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下的混合儲備標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，分別置于6個(gè)10 mL量瓶中，加丙酮定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度依次為0.05、0.1、0.5、1.0、2.0和5.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，加丙酮定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。

2.3.3 樣品溶液 取新鮮鐵皮石斛樣品，剪刀剪成0.5 cm小段，置粉碎機(jī)中粉碎；準(zhǔn)確稱取10.0 g粉碎后的樣品，置于50 mL離心管中，加30 mL乙腈，再加5.0 g NaCl，均質(zhì)3 min，8 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液10 mL待過柱；取HLB固相萃取小柱置于全自動(dòng)固相萃取儀上(先依次用6 mL純化水、6 mL甲醇、6 mL乙酸乙酯活化)，將上述上清液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，加12 mL丙酮洗脫，收集洗脫液，40～45 ℃氮?dú)獯抵两?，? mL丙酮溶解殘?jiān)瑴u旋1 min，0.45 μm濾膜過濾，即得樣品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.3.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)設(shè)置氣相色譜質(zhì)譜儀，穩(wěn)定后取上述溶液分別進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程，以3倍信號噪音比值(S/N)計(jì)算檢出限，10倍信號噪音比值(S/N)計(jì)算定量限。三唑酮、三唑醇、戊唑醇、腈苯唑和烯唑醇質(zhì)量濃度在0.05～5.0 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表3。

2.5 加樣回收率與重復(fù)性試驗(yàn)

取粉碎好的鐵皮石斛樣品10.0 g，精密加入1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使最終濃度分別為0.2、0.5、1.0 μg/mL，按“2.3.3”項(xiàng)下操作步驟對該樣品進(jìn)行前處理。按“2.1”和“2.2”項(xiàng)設(shè)置氣相色譜質(zhì)譜儀，測試3個(gè)不同濃度點(diǎn)的加標(biāo)回收結(jié)果。每個(gè)濃度點(diǎn)同法處理6次樣品，考察6次樣品進(jìn)樣的重復(fù)性，結(jié)果見表4。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.5”項(xiàng)下0.5 μg/mL的加標(biāo)溶液，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)設(shè)置氣相色譜質(zhì)譜儀，以MRM模式連續(xù)進(jìn)樣6次，測得三唑酮、三唑醇、戊唑醇、腈苯唑和烯唑醇6針進(jìn)樣精密度RSD值分別為2.12%、2.68%、3.05%、1.99%和0.76%，表明方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下樣品加標(biāo)溶液1份，室溫下放置0、4、8、12、18、24 h，待氣相色譜質(zhì)譜系統(tǒng)穩(wěn)定后，分別進(jìn)樣分析。測得三唑酮、三唑醇、戊唑醇、腈苯唑和烯唑醇色譜峰面積的RSD分別為2.01%、1.72%、3.32%、2.59%和1.85%，表明供試品溶液放置24 h穩(wěn)定。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table 3 Standard curves、correlation coefficients and linear ranges

表4 加樣回收率與重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery and repeatability tests

2.8 樣品測定結(jié)果

分別取6批次新鮮種植鐵皮石斛樣品按“2.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)設(shè)置氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，儀器穩(wěn)定后分別進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)樣品溶液和樣品溶液，記錄峰面積，外標(biāo)法計(jì)算樣品中三唑酮、三唑醇、戊唑醇、腈苯唑和烯唑醇?xì)埩袅?，結(jié)果表明，6批次樣品的檢測結(jié)果均為未檢出。典型樣品譜圖見圖1。

A.標(biāo)準(zhǔn)溶液； B.加標(biāo)樣品溶液； C.樣品溶液；

1.三唑酮； 2.三唑醇； 3.烯唑醇； 4.戊唑醇； 5.腈苯唑。

圖1 GC-MS/MS圖
Figure 1 GC-MS/MS chromatograms

3 討論

3.1 萃取溶劑的確定

農(nóng)藥殘留分析中，萃取效果的好壞關(guān)鍵是提取溶劑的選擇。根據(jù)“相似相溶”原理，萃取溶劑既要溶解待測農(nóng)藥，又要對色素、油脂等其他化合物有較低的提取率。乙腈為農(nóng)藥殘留分析中最常用的溶劑，因其對農(nóng)藥殘留有著廣譜的溶解性，且對油脂、色素等提取量低，在AOAC法[20]及農(nóng)業(yè)相關(guān)農(nóng)藥殘留測定[21]中廣泛的使用。本文選擇乙腈作為提取溶劑，結(jié)果表明回收率試驗(yàn)結(jié)果滿意。

3.2 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱是影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。目前常用萃取農(nóng)藥的固相萃取柱主要有Florisil柱、C18柱、NH2柱和HLB柱。Florisil 柱能很好地去除雜質(zhì)，但對極性較強(qiáng)的農(nóng)藥有很強(qiáng)的吸附作用；C18柱對色素凈化效果較差； NH2柱對脂溶性色素去除不完全，干擾較大；HLB柱萃取鐵皮石斛中的三唑類農(nóng)藥效果好且回收率高(見表5)。因此，本文選擇HLB柱凈化樣品。

表5 固相萃取柱的比較結(jié)果

Table 5 Comparison results of solid phase extraction columns

化合物回收率/%Florisil柱C18柱NH2柱HLB柱三唑酮82.384.280.388.5三唑醇81.469.583.989.0戊唑醇76.473.181.282.6腈苯唑87.181.887.189.8烯唑醇78.775.479.788.8

3.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

取“2.3”項(xiàng)下的5種三唑類農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(10 μg/mL)，首先進(jìn)行全掃描，得到每種農(nóng)藥的總離子流圖和前體離子，確定了每種農(nóng)藥的保留時(shí)間，對每個(gè)前體離子進(jìn)行再掃描得到相應(yīng)的離子對。選擇響應(yīng)高的一組作為定量離子對，另選2對作為定性離子對。保留時(shí)間結(jié)合定性離子對，避免假陽性結(jié)果的存在；選擇響應(yīng)高的離子對作為定量離子，確保了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。對該掃描方法進(jìn)行碰撞時(shí)間、碰撞電壓范圍、離子比率等進(jìn)行優(yōu)化，確立最終的多反應(yīng)監(jiān)測檢測方法(MRM)。

本文建立了固相萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測鐵皮石斛中5種三唑類農(nóng)藥殘留量的分析方法，結(jié)果表明該方法前處理簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，適用于鐵皮石斛中三唑類農(nóng)藥殘留量的監(jiān)測。