趙 瀅,劉利娥,韓 萍,何志東,趙宵帝

(鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室,河南鄭州 450001)

多糖是構(gòu)成生命活動(dòng)和維持生物功能的四大基本物質(zhì)之一[1],具有抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力、降血糖等生物學(xué)作用[2-5]。蔓菁(BrassicarapaL.)又名蕪菁、恰瑪古,是十字花科蕓薹屬兩年生具有藥食兩用價(jià)值的草本植物[6],其肉質(zhì)塊根中多糖含量豐富,是天然植物多糖的理想來(lái)源[7-8]。

目前蔓菁多糖的提取工藝主要為水浴提取[9-10],此方法耗時(shí)、耗能、提取產(chǎn)物活性低[11],所以需要對(duì)現(xiàn)有方法進(jìn)行優(yōu)化。新型超聲輔助提取法通過(guò)超聲波機(jī)械振動(dòng)產(chǎn)生空化作用促進(jìn)有效物質(zhì)與溶劑充分混合,提高傳質(zhì)速率,減少多糖的降解[12]。響應(yīng)面法可通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型準(zhǔn)確找出提取工藝中各影響因素的最佳組合方式,并對(duì)多糖得率的最優(yōu)值進(jìn)行預(yù)測(cè)[13]。蔡嘯鏑等[14]使用超聲輔助法提取新疆恰瑪古多糖,與普通水浴提取法相比[15],提取時(shí)間縮短了1.41 h,液料比減少了44.33%,省時(shí)節(jié)能。但此研究并未把超聲溫度這一重要影響因素納入到優(yōu)化條件當(dāng)中,所以超聲輔助提取蔓菁多糖工藝還需進(jìn)一步深入研究。

因此,本文利用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)建立多元回歸方程,以擬合超聲輔助提取過(guò)程中各因素與多糖得率之間的相關(guān)關(guān)系,得到最佳提取條件,多糖含量的測(cè)定采用改進(jìn)的苯酚硫酸法,并對(duì)所提取蔓菁多糖的抗氧化性進(jìn)行研究,旨在為蔓菁多糖進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔓菁 購(gòu)于新鄉(xiāng)市鳳泉區(qū),由鄭州大學(xué)潘成學(xué)副教授鑒定為蔓菁?jí)K根;正己烷、無(wú)水乙醇 分析純,天津市永大化學(xué)試劑有限公司;硫酸亞鐵 天津市化學(xué)試劑供銷(xiāo)公司;無(wú)水葡萄糖(分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥98%) 北京索萊寶科技有限公司;30%過(guò)氧化氫洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司;水楊酸 分析純,天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;抗壞血酸 分析純,天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;L420型臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;LGJ-18B型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;UV-1601紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;Spectra Max M2e型多功能微孔板讀數(shù)儀 上海美谷分子儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蔓菁多糖的提取與精制 將蔓菁?jí)K根洗凈、去皮、切成1 mm薄片、50 ℃烘干、粉碎后過(guò)60目篩,于正己烷中回流脫脂,濾渣在通風(fēng)櫥中干燥過(guò)夜。稱(chēng)取適量脫脂后的蔓菁粉末,按一定液料比加入蒸餾水,在一定超聲功率、一定溫度下提取一定時(shí)間,且提取2次,合并濾液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3,用Sevage法脫蛋白[16],所得上清液每100 mL加入2 g活性炭脫色,60 ℃水浴30 min后抽濾,濾液中加入95%乙醇至醇濃度達(dá)80%,4 ℃靜置過(guò)夜后離心,沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)清洗,真空冷凍干燥后即得蔓菁多糖。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 液料比對(duì)蔓菁多糖得率的影響 稱(chēng)取5份蔓菁粉末各0.5 g,按液料比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g加入蒸餾水,置于60 ℃水浴中超聲輔助提取50 min,功率為210 W,考察液料比對(duì)蔓菁多糖得率的影響。

1.2.2.2 提取溫度對(duì)蔓菁多糖得率的影響 稱(chēng)取5份蔓菁粉末各0.5 g,按液料比40∶1加入蒸餾水,分別置于40、50、60、70、80 ℃水浴中超聲輔助提取50 min,功率為210 W,考察提取溫度對(duì)蔓菁多糖得率的影響。

1.2.2.3 提取時(shí)間對(duì)蔓菁多糖得率的影響 稱(chēng)取5份蔓菁粉末各0.5 g,按液料比40∶1加入蒸餾水,置于60 ℃水浴中分別超聲輔助提取10、30、50、70、90 min,功率為210 W,考察提取時(shí)間對(duì)蔓菁多糖得率的影響。

1.2.2.4 超聲功率對(duì)蔓菁多糖得率的影響 稱(chēng)取5份蔓菁粉末各0.5 g,按液料比40∶1加入蒸餾水,置于60 ℃水浴中超聲輔助提取50 min,功率分別為150、180、210、240、270 W,考察超聲功率對(duì)蔓菁多糖得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以液料比、提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率為試驗(yàn)因素,以蔓菁多糖得率為響應(yīng)值,運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken中心組合法則進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),以確定蔓菁多糖的最佳提取條件,試驗(yàn)4因素3水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 蔓菁多糖得率的測(cè)定

1.2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(0.1 mg/L)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mL至25 mL具塞試管中,蒸餾水定容至2.0 mL,分別加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL濃硫酸,混合均勻后靜置10 min,沸水浴加熱15 min,冷卻至室溫,以2.0 mL蒸餾水為空白,于490 nm處測(cè)吸光度,以葡萄糖濃度(x)為橫坐標(biāo),吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為y=15.5698x-0.0184,R2=0.9988。

1.2.4.2 換算因子的測(cè)定 參照吳擁軍等[17]試驗(yàn)方法,并稍作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥至恒重的蔓菁多糖10 mg,加水定容至100 mL,吸取1 mL,用蒸餾水定容至2 mL,按照1.2.4.1中的步驟顯色并測(cè)其吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所得的回歸方程計(jì)算多糖溶液中葡萄糖的濃度,計(jì)算換算因子f=m/(c×d×v),式中m為多糖質(zhì)量(mg),c為多糖溶液中葡萄糖濃度(mg/mL),d為多糖溶液的稀釋倍數(shù),v為體積(mL)。計(jì)算得到f=1.4281。

1.2.4.3 樣品中蔓菁多糖得率測(cè)定 精密稱(chēng)取蔓菁粉末0.5 g,按一定液料比、提取溫度、提取時(shí)間、功率超聲提取兩次,抽濾、合并濾液,定容于100 mL容量瓶中,取1 mL置于50 mL容量瓶中定容,取2 mL濾液置于具塞試管中,按照“1.2.4.1”中的步驟顯色并測(cè)其吸光度,由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和換算因子計(jì)算多糖得率。

多糖得率(%)=(c×d×v×f)/m

式中,c為待測(cè)溶液中葡萄糖濃度,mg/mL;d為稀釋倍數(shù);v為待測(cè)溶液體積,mL;f為換算因子;m為蔓菁粉末質(zhì)量,mg。

1.2.5 蔓菁多糖對(duì)·OH清除力測(cè)定 參照Yu等[18]方法。吸取100 μL 2.00 mg/L的蔓菁多糖溶液于96孔板中,進(jìn)行2倍梯度稀釋,配成濃度為2.00、1.00、0.50、0.25、0.13 mg/L的溶液。每孔依次加入50 μL 8.98 mmol/L的硫酸亞鐵溶液、50 μL 8.93 mmol/L的水楊酸乙醇溶液、50 μL 9.00 mmol/L的過(guò)氧化氫溶液,置37 ℃恒溫箱中30 min。相同濃度冷凍干燥后的蔓菁多糖樣品做3組平行試驗(yàn),在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)吸光度Ai,用等量去離子水分別替換過(guò)氧化氫溶液和樣品多糖溶液,測(cè)定Aj和Ac。以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照,濃度等梯度稀釋為6.00、3.00、1.50、0.75、0.38、0.19、0.09 mg/mL。·OH清除率由以下公式計(jì)算獲得,IC50值表示·OH清除率達(dá)50%時(shí)所需的樣品質(zhì)量濃度,常用IC50值的大小表示樣品抗氧化性的高低。

式中:Ai為樣品組吸光度;Aj為去離子水代替過(guò)氧化氫溶液測(cè)得對(duì)照組的吸光度;Ac為空白組吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)平行測(cè)定三次,所得結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用Microsoft Excel 2016軟件、Origin軟件和Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及繪圖制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)蔓菁多糖得率的影響 由圖1可知,當(dāng)液料比從20∶1 (mL/g)增至40∶1 (mL/g),蔓菁多糖得率逐漸升高,其原因可能是液料比較低時(shí)溶液的粘稠度大,超聲波對(duì)細(xì)胞的空化作用較弱,加之細(xì)胞內(nèi)外溶質(zhì)的濃度差較小,不利于多糖溶出,隨著蒸餾水量的增加,溶液粘稠度降低,細(xì)胞內(nèi)外多糖的濃度差增大,有利于多糖向溶劑中擴(kuò)散[19-20]。當(dāng)液料比增至為40∶1 (mL/g)時(shí),多糖得率達(dá)到最大值為64.87%,之后隨著液料比繼續(xù)增加,超聲波所產(chǎn)生的能量大多被溶劑吸收,并且雜質(zhì)溶出較多,多糖得率反而下降[20]。因此,液料比為40∶1 (mL/g)最合適。

圖1 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio on yield of polysaccharides

2.1.2 提取溫度對(duì)蔓菁多糖得率的影響由圖2可知,隨著溫度從40 ℃升高到60 ℃,多糖得率顯著提高,60 ℃達(dá)到最大值65.19%,一方面可能是因?yàn)樵谶m當(dāng)范圍內(nèi)升高溫度可降低溶液的粘稠度,增加多糖在溶液中的溶解度和擴(kuò)散性,從而提高了多糖得率。另一方面,適當(dāng)升溫可增加超聲所產(chǎn)生的空化作用,加大細(xì)胞損傷,促使細(xì)胞內(nèi)多糖向外界溶出,從而使多糖得率升高[21]。當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)繼續(xù)升溫,高溫不僅會(huì)造成多糖的分解還會(huì)使溶液中的大量水分蒸發(fā),從而使多糖得率降低[22]。因此,適宜的提取溫度為60 ℃。

圖2 提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on yield of polysaccharides

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)蔓菁多糖得率的影響 由圖3可知,隨著提取時(shí)間的增加,蔓菁多糖的得率逐漸升高,在50 min時(shí)達(dá)到最大值64.78%,繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間,多糖得率反而下降。這種現(xiàn)象可以解釋為,在提取的早期,超聲波產(chǎn)生的空化作用使蔓菁細(xì)胞逐漸破裂,增加了提取液與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的接觸面積,促進(jìn)了多糖的溶出,從而得率升高。但隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),提取液蒸發(fā)減少,蔓菁多糖溶出趨于飽和,并且會(huì)造成多糖的降解[23]。因此,從節(jié)約時(shí)間和提取效果的角度考慮,適宜的提取時(shí)間為50 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of polysaccharides

2.1.4 超聲功率對(duì)蔓菁多糖得率的影響由 圖4可知,超聲功率在150～270 W之間時(shí),蔓菁多糖的得率隨功率的增加先升高后降低。隨著功率的增大,超聲波對(duì)細(xì)胞的作用越強(qiáng),使細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性增加,從而增加多糖傳質(zhì)速率,使多糖產(chǎn)量增加[21]。當(dāng)功率超過(guò)180 W,過(guò)大的超聲功率會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu),從而使得率降低[14]。因此,超聲功率為180 W較合適。

圖4 超聲功率對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on yield of polysaccharides

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù),選取液料比(mL/g)、提取溫度(℃)、提取時(shí)間(min)和超聲功率(W)為自變量,蔓菁多糖得率為響應(yīng)值,通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析,所得試驗(yàn)組合和結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 2 Design and response value of Box-Behnken experiment

2.2.2 模型的建立與統(tǒng)計(jì)分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到蔓菁多糖得率Y(%)對(duì)編碼自變量液料比A(mL/g)、提取溫度B(℃)、提取時(shí)間C(min)和超聲功率D(W)的四元二次回歸方程:Y=65.39+0.4A-0.044B+0.21C-0.032D-0.18AB-0.05AC+0.42AD-0.42BC-0.065BD+0.015CD-0.6A2-0.48B2-0.48C2-0.74D2。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖可以直觀反映研究因素及其交互作用對(duì)蔓菁多糖得率的影響,響應(yīng)面圖中曲線(xiàn)越彎曲說(shuō)明研究因素對(duì)多糖得率影響越大,等高線(xiàn)呈橢圓形說(shuō)明研究因素之間的交互作用顯著[24]。如圖5所示,液料比與提取溫度之間存在顯著交互作用,固定液料比,多糖得率隨溫度的升高先緩慢增加后有降低趨勢(shì),在同一溫度下,多糖得率隨液料比的增加先升高后降低。圖6顯示,液料比與超聲功率之間的交互作用極顯著,在一定液料比下,多糖得率隨超聲功率的增加先升高后降低,對(duì)于同一超聲功率,多糖得率隨液料比的增加先升高后趨于平穩(wěn),由響應(yīng)面圖兩側(cè)彎曲程度可以看出液料比對(duì)多糖得率的影響大于超聲功率。由圖7可知,溫度與時(shí)間之間的交互作用極顯著,當(dāng)溫度固定時(shí),多糖得率隨時(shí)間增加先升高后降低,當(dāng)時(shí)間固定時(shí),多糖得率的變化趨勢(shì)隨溫度的升高也呈現(xiàn)出相同的變化。

圖5 液料比和提取溫度的交互作用對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.5 Response surface and contour plots of the interaction effect between liquid-solid ratio and extraction temperature on yield of polysaccharides

圖6 液料比和超聲功率的交互作用對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.6 Response surface and contour plots of the interaction effect between liquid-solid ratio and ultrasonic power on yield of polysaccharides

圖7 提取溫度和時(shí)間的交互作用對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.7 Response surface and contour plots of the interaction effect between extraction temperature and time on yield of polysaccharides

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化分析結(jié)果顯示,超聲輔助提取蔓菁多糖的最佳提取工藝為液料比44.04∶1 (mL/g),提取溫度57.28 ℃,提取時(shí)間56.43 min,超聲功率183.27 W。根據(jù)儀器的實(shí)際操作范圍將此條件稍作修改,最佳提取參數(shù)設(shè)定為液料比44∶1 (mL/g),提取溫度57 ℃,提取時(shí)間56 min,超聲功率為180 W,在此條件下蔓菁多糖得率的預(yù)測(cè)值為65.51%,進(jìn)行三次平行試驗(yàn)得到實(shí)際值為65.43%,兩者的相對(duì)誤差為0.12%,說(shuō)明該擬合模型具有可靠性。

2.3 對(duì)·OH的清除作用

通過(guò)Fenton體系產(chǎn)生·OH與水楊酸混合后的產(chǎn)物在510 nm處有特殊吸收。加入自由基清除劑后,·OH數(shù)量減少,與水楊酸的反應(yīng)產(chǎn)物減少,吸光度值降低[25]。因此,可以根據(jù)吸光度值降低的程度判斷蔓菁多糖對(duì)·OH的清除情況。如圖8所示,隨著蔓菁多糖的濃度增加,·OH的清除率隨之增加,說(shuō)明蔓菁多糖對(duì)·OH的清除能力具有濃度依賴(lài)性,當(dāng)蔓菁多糖濃度為2 mg/mL時(shí),對(duì)·OH清除率達(dá)到最大為95.78%。蔓菁多糖對(duì)·OH清除率的回歸方程為y=23.212lnx+70.412,其R2=0.9078。根據(jù)回歸方程可知蔓菁多糖IC50=0.415 mg/mL,而抗壞血酸IC50=0.883 mg/mL,一般認(rèn)為IC50值小于10 mg/mL,該物質(zhì)具有較好的抗氧化性[26]?？梢?jiàn)蔓菁多糖對(duì)于·OH的清除能力大于抗壞血酸對(duì)·OH的清除能力,蔓菁多糖具有較強(qiáng)的抗氧化性。

圖8 蔓菁多糖對(duì)·OH的清除作用Fig.8 ·OH scavenging activity of polysaccharides from turnip

3 結(jié)論與討論

本研究采用超聲法輔助提取蔓菁中天然多糖成分,并對(duì)提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。得到最佳提取工藝:液料比44∶1 (mL/g),提取溫度57 ℃,提取時(shí)間56 min,超聲功率180 W。經(jīng)驗(yàn)證,蔓菁多糖得率的實(shí)際值為65.43%,與模型預(yù)測(cè)值偏差較小,說(shuō)明此優(yōu)化工藝參數(shù)具有實(shí)際參考價(jià)值。王偉等用響應(yīng)面法優(yōu)化新疆蕪菁多糖的提取工藝,確定了提取工藝的最優(yōu)條件:液料比75∶1 (mL/g),提取溫度93 ℃,提取時(shí)間4.3 h,提取次數(shù)3次,多糖得率為23.72%[10]。對(duì)比可知,本研究采用超聲輔助提取法在很大程度上減少了液料比、降低了提取溫度、使提取時(shí)間縮短3.4 h、多糖得率大幅度提高。蔡嘯鏑等[14]用超聲輔助法提取恰瑪古多糖,對(duì)液料比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率進(jìn)行優(yōu)化,多糖得率為6.86%。與該研究結(jié)果相差較大,原因可能有三個(gè)方面:一是提取工藝的優(yōu)化參數(shù)不同,有研究表明提取溫度對(duì)多糖得率的影響大于乙醇體積分?jǐn)?shù)[27],而本實(shí)驗(yàn)將提取溫度納入到提取工藝的優(yōu)化條件當(dāng)中,顯示提取溫度對(duì)多糖得率有重要影響;二是與測(cè)定方法有關(guān),本試驗(yàn)采用改進(jìn)的苯酚硫酸法測(cè)定溶液中蔓菁多糖的含量,以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,用精制蔓菁多糖計(jì)算換算因子,減少了單純用葡萄糖濃度來(lái)推算蔓菁多糖含量所引起的系統(tǒng)誤差,此外,直接測(cè)定提取液中蔓菁多糖含量并計(jì)算多糖得率,比從提取液中通過(guò)脫蛋白、脫色素、冷凍干燥后計(jì)算多糖與蔓菁原材料的質(zhì)量之比的方式更為精確,減少了純化過(guò)程中造成的多糖損失;三是不同產(chǎn)地的蔓菁多糖含量差別較大[28]。

·OH是體內(nèi)活性最強(qiáng)、毒性最大、半衰期最短的強(qiáng)氧化劑,幾乎可以和體內(nèi)所有分子發(fā)生反應(yīng)[25],因此研究蔓菁多糖對(duì)·OH的清除作用對(duì)研究其抗氧化性具有指導(dǎo)意義。體外抗氧化試驗(yàn)表明,本研究所采用的新鄉(xiāng)蔓菁提取的多糖對(duì)·OH的清除能力較強(qiáng),IC50=0.415 mg/mL。數(shù)據(jù)結(jié)果優(yōu)于張謙筱等所研究的新疆蔓菁多糖對(duì)·OH的清除作用,IC50=0.7 mg/mL[29]。因此,新鄉(xiāng)蔓菁多糖具有較好的抗氧化活性,進(jìn)一步增加了其開(kāi)發(fā)利用的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

綜上所述,本研究通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取蔓菁多糖工藝,所得最優(yōu)提取參數(shù)有效可行,有益于蔓菁多糖作為天然抗氧化劑在食品、藥品、化妝品、保健品等領(lǐng)域中的推廣應(yīng)用。