郭 翔

(重慶人文科技學(xué)院,重慶 401524)

運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品是針對(duì)運(yùn)動(dòng)人群開發(fā)的一類補(bǔ)充蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)元素的食品,在近些年開始越來越流行,其中以補(bǔ)充蛋白質(zhì)類在運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品較多[1]。而蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑多數(shù)以人工飼養(yǎng)畜禽類的動(dòng)物源性原料制成,然而此類畜禽在飼養(yǎng)過程中易受到β-受體激動(dòng)劑濫用的影響[2-3],造成最終產(chǎn)品中此類受體激動(dòng)劑的超標(biāo)。因此我國加大了對(duì)明令禁止的15種β-受體激動(dòng)劑非法使用的打擊力度,然而具有促進(jìn)動(dòng)物生長、提高瘦肉率功效,而未被列入國家禁用藥物名單的β-受體激動(dòng)劑同系物或衍生物,如α2-受體激動(dòng)劑(可樂定、賽庚啶、賽拉嗪、右美托咪啶、胍那芐等),此類受體激動(dòng)劑在動(dòng)物促生長方面也有明顯的效果,可顯著提高豬的瘦肉率,降低了脂肪比率和背膘厚[4-5]。然而我國針對(duì)α2-受體激動(dòng)劑類藥物發(fā)布相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)不多[6-7],仍然缺乏對(duì)多種α2-受體激動(dòng)劑類藥物檢測(cè)的方法標(biāo)準(zhǔn)。因此建立以含動(dòng)物源性蛋白為基質(zhì)的食品中α2-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)方法十分必要,特別是對(duì)運(yùn)動(dòng)員這類特殊人群的運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中受體激動(dòng)劑的篩查檢測(cè),評(píng)價(jià)此類食品的安全具有重要意義。

目前國內(nèi)外檢測(cè)α2-受體激動(dòng)劑的方法主要有毛細(xì)管電泳法(Capillary electrophoresis,CE)、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,HPLC-MS)、毛細(xì)管電泳-色譜聯(lián)用法(Capillary Electrophoresis Chromatography-Excited Induced Fluorescence,CEC-LIF)等[8-12]。毛細(xì)管電泳法由于方法的局限性,檢測(cè)靈敏度一般不高[13];而高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法雖然方法的靈敏度能達(dá)到,但是樣品的前處理復(fù)雜,步驟繁瑣,限制了其實(shí)際的使用范圍[14-15];而CEC-LIF,兼具了高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法的雙重分離機(jī)制,并結(jié)合運(yùn)用了靈敏度與選擇性極強(qiáng)的激光誘導(dǎo)熒光技術(shù),檢測(cè)的靈敏度可以達(dá)到納克級(jí)別,可以檢測(cè)多種微量的α2-受體激動(dòng)劑[16-18]。CEC-LIF結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)的研究國內(nèi)外也有報(bào)道,Nguyen等[19]采用4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并呋咱(4-fluoro-7-nitrobenzofurazan,NBD-F)熒光衍生結(jié)合毛細(xì)管區(qū)帶電泳聯(lián)用技術(shù),快速靈敏地分離檢測(cè)了食品中的精胺和組胺;雷霄云等[20]采用毛細(xì)管電色譜-激發(fā)誘導(dǎo)熒光檢測(cè)動(dòng)物性食品中多肽類抗生素,所建立方法的靈敏度能滿足對(duì)多肽類獸藥的殘留檢測(cè)要求;Sapan等[21]以NBD-F為柱前衍生試劑,結(jié)合HPLC-熒光檢測(cè)(FD)分析了大鼠血漿中的氨基酸,檢出限可達(dá)2.8～20 fmol。但是針對(duì)運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品這類基質(zhì)較復(fù)雜的樣品,前處理的過程、衍生條件的控制以及儀器參數(shù)的選擇等都會(huì)對(duì)α2-受體激動(dòng)劑的測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。所以本實(shí)驗(yàn)在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[19-23],優(yōu)化相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件,建立一種毛細(xì)管電泳-色譜聯(lián)用測(cè)定運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中α2-受體激動(dòng)劑的方法,以滿足我國市場(chǎng)上對(duì)此類檢測(cè)的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α2-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品(賽拉嗪99.6%、右美托咪啶99.3%、胍那芐98.5%) 上海安譜公司產(chǎn)品;硼酸(分析純) 中國化學(xué)試劑研究所;乙腈和乙醇(色譜純) 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;衍生試劑NBD-F純度97% 日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社;樣品 隨機(jī)購買于超市的動(dòng)物源性運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品。

Risep-610型毛細(xì)管電泳-色譜分析系統(tǒng) 賽默飛世爾公司;2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司;4100型激發(fā)誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器 中科院大連物化研究所;KQ-500數(shù)控超聲波儀 昆山市超聲波儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 實(shí)驗(yàn)稱取2.00 g樣品于20 mL離心管中,分別加入5 mL乙酸鉛(20 mg/L)以及5 mL三氯乙酸(20 mg/L)進(jìn)行超聲(功率500 W,40 kHz)提取30 min,4000 r/min離心15 min后移取上清液;將上清液加入到Oasis HLB固相萃取柱,分別用6 mL甲醇和水依次活化后上樣,首先棄去流出液,然后用6 mL水洗滌,棄去流出液,用6 mL甲醇洗脫,收集洗脫液并于40 ℃氮?dú)獯蹈?。殘余樣品?.0 mL流動(dòng)相溶解混勻,用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾,再進(jìn)行熒光衍生反應(yīng)并毛細(xì)管電泳-色譜檢測(cè)。

1.2.2 熒光衍生反應(yīng)條件的優(yōu)化 取濃度為5 μg/mL的賽拉嗪、右美托咪啶和胍那芐的α2-受體激動(dòng)劑物質(zhì)混合溶液200 μL,加入200 μL硼酸溶液(50 mmol/L)、200 μL乙醇后,再加入200 μL NBD-F溶液,避光進(jìn)行衍生反應(yīng)。分別研究衍生劑濃度、衍生反應(yīng)pH、衍生反應(yīng)時(shí)間以及衍生反應(yīng)溫度對(duì)衍生反應(yīng)的影響,以3種目標(biāo)物的平均回收率作為判定指標(biāo)。激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器參數(shù)為分離電壓:-10 kV、輔助壓力:3.8 MPa、檢測(cè)波長:λex/λem=473 nm/530 nm。

1.2.2.1 衍生劑濃度的選擇 在對(duì)3種α2-受體激動(dòng)劑進(jìn)行衍生反應(yīng)時(shí),需要加入適量的NBD-F來保證目標(biāo)物質(zhì)的完全反應(yīng),使衍生效率達(dá)到最大,但過量的NBD-F試劑將增大背景干擾,導(dǎo)致分離效率降低,無法準(zhǔn)確定量。本實(shí)驗(yàn)在衍生反應(yīng)pH7.2、衍生反應(yīng)時(shí)間20 min、衍生反應(yīng)溫度40 ℃的條件下,分別考察NBD-F濃度在0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0 mmol/L時(shí),對(duì)3種α2-受體激動(dòng)劑平均回收率的影響。

1.2.2.2 衍生反應(yīng)pH的選擇 賽拉嗪、右美托咪啶以及胍那芐的衍生化氨基反應(yīng)一般是在堿性條件下進(jìn)行的,本實(shí)驗(yàn)在衍生劑NBD-F濃度1.0 mmol/L、衍生反應(yīng)時(shí)間20 min、衍生反應(yīng)溫度40 ℃的條件下,分別考察衍生反應(yīng)pH在6.6、7.2、7.8、8.3、8.9、9.5、10.1、10.7時(shí),對(duì)3種α2-受體激動(dòng)劑平均回收率的影響。

1.2.2.3 衍生反應(yīng)時(shí)間的選擇 衍生反應(yīng)的時(shí)間會(huì)對(duì)衍生反應(yīng)的反應(yīng)程度以及衍生物的量產(chǎn)生影響,本實(shí)驗(yàn)在衍生劑NBD-F濃度1.0 mmol/L、衍生反應(yīng)pH8.9、衍生反應(yīng)溫度40 ℃的條件下,分別考察衍生反應(yīng)時(shí)間在5、10、15、20、25、30、35、40 min時(shí),對(duì)3種α2-受體激動(dòng)劑平均回收率的影響。

1.2.2.4 衍生反應(yīng)溫度的選擇 賽拉嗪、右美托咪啶以及胍那芐在高溫下不穩(wěn)定,為了保證目標(biāo)物的穩(wěn)定性,實(shí)驗(yàn)在衍生劑NBD-F濃度1.0 mmol/L、衍生反應(yīng)pH8.9、衍生反應(yīng)時(shí)間30 min的條件下,考察衍生反應(yīng)溫度在30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃時(shí),對(duì)3種α2-受體激動(dòng)劑平均回收率的影響。

1.2.3 色譜條件的優(yōu)化 色譜條件:色譜柱選擇苯基毛細(xì)管電色譜填充柱(50 μm×55 cm,3 μm);流速:0.03 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:30 ℃。3種α2-受體激動(dòng)劑的色譜分離選用乙腈-磷酸鉀緩沖液流動(dòng)相體系,分別考察磷酸鉀緩沖液的濃度以及乙腈的比例對(duì)3種目標(biāo)物衍生物分離的影響。

1.2.3.1 流動(dòng)相中磷酸鉀濃度的選擇 在毛細(xì)管電泳色譜分離過程中,流動(dòng)相的主要驅(qū)動(dòng)力來自壓力流、電泳力或電滲流,而流動(dòng)相的黏度影響電泳遷移率和電滲流的大小,所以本實(shí)驗(yàn)固定流動(dòng)相乙腈-磷酸鉀緩沖液(55∶45,v/v)的比例,分別考察磷酸鉀濃度為5、10、15、20 mmol/L時(shí),3種α2-受體激動(dòng)劑衍生物在色譜圖上的分離效果。

1.2.3.2 流動(dòng)相中乙腈比例的選擇 在乙腈-磷酸鉀緩沖液流動(dòng)相體系中,乙腈比例的大小影響著流動(dòng)相的極性,同時(shí)也影響目標(biāo)物的色譜保留行為。本實(shí)驗(yàn)固定流動(dòng)相中磷酸鉀濃度為10 mmol/L,分別考察乙腈比例為50%、55%、58%、60%時(shí),3種α2-受體激動(dòng)劑衍生物在色譜圖上的分離效果。

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證 配制一系列不同質(zhì)量濃度的α2-受體激動(dòng)劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL),在優(yōu)化好的熒光衍生和色譜條件下,進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作、穩(wěn)定性與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光衍生反應(yīng)條件的優(yōu)化

賽拉嗪、右美托咪啶以及胍那芐的化學(xué)結(jié)構(gòu)中沒有熒光發(fā)色基團(tuán),且紫外吸收弱,需要通過NBD-F衍生后才有熒光反應(yīng),衍生原理見圖1。

圖1 NBD-F衍生含氨基化合物的原理圖Fig.1 Schematic diagram of derivatization for aminocontaining compounds with NBD-F

衍生反應(yīng)中,3種α2-受體激動(dòng)劑與NBD-F的反應(yīng)程度會(huì)影響到待測(cè)目標(biāo)物被檢出的量,所以衍生劑濃度、衍生反應(yīng)pH、衍生反應(yīng)的時(shí)間和溫度都對(duì)其有影響,本實(shí)驗(yàn)要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化,以達(dá)到最優(yōu)的目標(biāo)回收率。

2.1.1 衍生劑濃度的選擇 由圖2可知,在0.1～1.0 mmol/L范圍內(nèi),隨著衍生試劑濃度的增加,3種α2-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)回收率的逐漸提高,說明衍生反應(yīng)也越完全,并在1.0 mmol/L時(shí)回收率達(dá)到最大值,表明衍生反應(yīng)基本完全;繼續(xù)增大衍生劑的濃度,將導(dǎo)致衍生試劑和水解產(chǎn)物殘留,熒光效率不再增加[18]。因此選擇1.0 mmol/L的衍生試劑濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 衍生劑濃度對(duì)α2-受體激動(dòng)劑平均回收率的影響(n=5)Fig.2 Effect of derivatives concentration on average recovery rate of α2-receptor agonists(n=5)

2.1.2 衍生反應(yīng)pH的選擇 由圖3可知,衍生反應(yīng)體系溶液的pH在6.6～10.7范圍內(nèi),隨著pH的增大,反應(yīng)體系的堿性增強(qiáng),增加了衍生試劑與α2-受體激動(dòng)劑的反應(yīng)的概率,熒光響應(yīng)有顯著提高,當(dāng)pH為8.9時(shí)達(dá)到最大;繼續(xù)增大pH,此時(shí)目標(biāo)物不穩(wěn)定易分解,造成衍生效率下降,副產(chǎn)物增多[19],因此將反應(yīng)體系溶液的pH設(shè)為8.9。

2.1.3 衍生反應(yīng)時(shí)間的選擇 由圖4可知,適當(dāng)延長衍生反應(yīng)時(shí)間有助于熒光衍生效率的提高。當(dāng)衍生反應(yīng)在5～30 min范圍內(nèi),隨著衍生反應(yīng)時(shí)間的延長,衍生產(chǎn)物的回收率不斷提高;當(dāng)衍生反應(yīng)提高到30 min時(shí),3種α2-受體激動(dòng)劑的衍生產(chǎn)物回收率達(dá)到最大值,繼續(xù)延長衍生反應(yīng)時(shí)間容易使衍生試劑水解產(chǎn)物增多,干擾分析[20]。因此將衍生反應(yīng)時(shí)間設(shè)為30 min。

圖4 衍生反應(yīng)時(shí)間對(duì)α2-受體激動(dòng)劑平均回收率的影響(n=5)Fig.4 Effect of derivative reaction time on average recovery rate of α2-receptor agonists(n=5)

2.1.4 衍生反應(yīng)溫度的選擇 由圖5可知,當(dāng)溫度較低時(shí),衍生劑與受體激動(dòng)劑的反應(yīng)概率較小,熒光衍生效率較低,隨著反應(yīng)溫度逐漸加大,衍生效率逐漸增加,60 ℃時(shí),產(chǎn)物的熒光效率達(dá)到最大;再增大反應(yīng)溫度會(huì)增加熒光分子與溶劑分子相互碰撞淬滅的概率,使熒光量子產(chǎn)率變小,而且溫度過高會(huì)產(chǎn)生更多的副產(chǎn)物,干擾對(duì)目標(biāo)物的分離分析[20]。因此最終將衍生反應(yīng)溫度設(shè)為60 ℃。

圖5 衍生反應(yīng)溫度對(duì)α2-受體激動(dòng)劑平均回收率的影響(n=5)Fig.5 Effect of derivative reaction temperature on the average recovery rate of α2-receptor agonists(n=5)

2.2 色譜條件的優(yōu)化選擇

2.2.1 流動(dòng)相中磷酸鉀濃度選擇 結(jié)果如圖6所示,隨著磷酸鉀緩沖液濃度的增大,流動(dòng)相黏度逐漸變大,擴(kuò)散系數(shù)逐漸變小,使得雙電層厚度減小,管壁的Zeta電勢(shì)也逐漸減小,導(dǎo)致電滲流變小,目標(biāo)物分析時(shí)間延長。其中,右美托咪啶和胍那芐熒光衍生產(chǎn)物色譜峰的保留時(shí)間增加趨勢(shì)較明顯,這可能是由于在pH5.0時(shí)這兩種物質(zhì)帶負(fù)電荷,電泳方向與電滲流方向相反;賽拉嗪的熒光衍生產(chǎn)物此時(shí)更趨向于中性分子,所以色譜峰保留時(shí)間主要受電滲流影響,變化略小[17,21]。綜合考慮分析物的保留時(shí)間、分離度和峰形,實(shí)驗(yàn)選擇10 mmol/L磷酸鉀鹽溶液作為流動(dòng)相緩沖液。

圖6 緩沖液濃度對(duì)α2-受體激動(dòng)劑色譜分離的影響Fig.6 Effect of buffer concentration on chromatographic separation of α2-receptor agonists注:峰1和峰2為賽拉嗪;峰3和峰4為右美托咪啶;峰5和峰6為胍那芐;NBD-OH:4-氟-7-羥基-2,1,3-苯并惡二唑;圖7同。

2.2.2 流動(dòng)相中乙腈比例的選擇 結(jié)果如圖7所示,隨著乙腈比例的增加,目標(biāo)物在色譜柱上的保留時(shí)間減少,這是由于乙腈比例的增加使得流動(dòng)相的黏度減小,Zeta電位和電滲流變大,降低了目標(biāo)物在苯基反相柱上的保留[21]。當(dāng)乙腈的體積分?jǐn)?shù)超過55%時(shí),雖然分析物的響應(yīng)值有明顯的增大,但是分離度卻有所降低[22]。綜合考慮,將流動(dòng)相中乙腈的體積分?jǐn)?shù)設(shè)為55%。

圖7 乙腈比例對(duì)α2-受體激動(dòng)劑分離的影響Fig.7 Effect of ACN ratio on the separation of α2-receptor agonists

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3種目標(biāo)組分在1.0～20.0 ng/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系(R2>0.99),并得到3種目標(biāo)組分的LOD均為5.0 μg/kg,LOQ均為16.0 μg/kg,結(jié)果見表1。

表1 3種α2-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1 Standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of three α2-receptor agonists

現(xiàn)有α2-受體激動(dòng)劑分析方法可以參考飼料中可樂定和賽庚啶的測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法[5-6],采用UPLC-MS/MS法,其使用成本與操作要求均較高,檢出限為50 μg/kg。本方法無需梯度洗脫,衍生快速高效,檢出限更低,而且可以避免大量非熒光雜質(zhì)的干擾,對(duì)于運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品食品中α2-受體激動(dòng)劑類物質(zhì)的檢測(cè)具有適用性。

2.3.2 穩(wěn)定性與重復(fù)性 在最優(yōu)條件下,對(duì)20.0 ng/mL的3種α2-受體激動(dòng)劑物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行熒光衍生和CEC-LIF檢測(cè)分析,連續(xù)測(cè)定7 d,每天進(jìn)樣3次,測(cè)得3種目標(biāo)物保留時(shí)間的日間和日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.5%～8.6%和3.1%～3.7%;峰面積的日間和日內(nèi)RSD分別為3.3%～7.5%和2.6%～2.9%。說明該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好,可用于3種α2-受體激動(dòng)劑物質(zhì)的分析研究。

2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

利用空白基質(zhì)的樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSD)of the method(n=5)

由表2可見,3種α2-受體激動(dòng)劑的加標(biāo)回收率為80.5%～93.4%,RSD為2.4%～7.1%,表明本實(shí)驗(yàn)所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。

3 結(jié)論

本文建立了一種毛細(xì)管電色譜與激光誘導(dǎo)熒光聯(lián)用檢測(cè)運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中賽拉嗪、右美托咪啶、胍那芐等3種α2-受體激動(dòng)劑的分析方法。衍生反應(yīng)選擇NBD-F濃度為1.0 mmol/L、衍生反應(yīng)pH為8.9、衍生反應(yīng)時(shí)間為30 min以及衍生反應(yīng)溫度為60 ℃的條件下,以乙腈-磷酸鉀(10 mmol/L)(55∶45,v/v)為流動(dòng)相,經(jīng)苯基毛細(xì)管色譜填充柱進(jìn)行分離,3種α2-受體激動(dòng)劑能在1.0～20.0 ng/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,3種組分的LOD均為5.0 μg/kg,LOQ均為16.0 μg/kg。樣品中3種α2-受體激動(dòng)劑的加標(biāo)回收率為80.5%～93.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～7.1%,所建立的方法有效解決了測(cè)定這類α2-受體激動(dòng)劑樣品時(shí)樣品前處理復(fù)雜、回收率低的分析難點(diǎn),可為運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中α2-受體激動(dòng)劑的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。