王虹懿,吳海虹,張新笑,劉 芳,3,孫芝蘭,3,*,諸永志,王道營(yíng),徐為民,彭 景

(1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225127;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014;3.省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210014)

細(xì)菌的群體感應(yīng)也稱(chēng)自身誘導(dǎo),是指細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生和感應(yīng)信號(hào)分子濃度的變化來(lái)檢測(cè)其群體密度,進(jìn)而調(diào)控群體行為的過(guò)程。自身誘導(dǎo)物隨著細(xì)菌密度的增高而增高,當(dāng)自身誘導(dǎo)物達(dá)到某一閾值后,會(huì)與一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子結(jié)合,從而誘導(dǎo)或抑制多種基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing system,QS)主要參與調(diào)控細(xì)菌胞外酶的分泌、毒力因子的表達(dá)和細(xì)菌運(yùn)動(dòng)等生理性狀[1-2]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)革蘭氏陰性菌通過(guò)QS機(jī)制分泌并感應(yīng)?；呓z氨酸內(nèi)酯類(lèi)分子類(lèi)信號(hào)分子(N-acylhomoserine lactones,AHLs)來(lái)判斷菌群密度,并以此濃度閾值來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)菌相關(guān)腐敗基因的表達(dá),進(jìn)而在食品腐敗過(guò)程中發(fā)揮致腐作用[3]。群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitors,QSIs)指對(duì)細(xì)菌間信息交流具有阻礙作用,干擾或抑制QS現(xiàn)象,且對(duì)細(xì)菌正常生命活動(dòng)不造成破壞的物質(zhì)。天然來(lái)源的QSI濃度低且毒性小,利用天然 QSI 阻斷細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng),降低腐敗菌致腐能力成為當(dāng)前人類(lèi)研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)阿魏精油作為一種新型的QSI可顯著抑制紫色桿菌的QS現(xiàn)象[4]。Chow等[5]報(bào)道了水楊酸對(duì)銅綠假單胞菌 QS 現(xiàn)象具有抑制作用,可有效降低其毒力效應(yīng)。目前已從藥用植物、果蔬、海洋藻類(lèi)中分離出具有抑制群體感應(yīng)的天然活性物質(zhì)。綠原酸是具有生物抑菌活性的天然植物源生物防腐劑[6],目前已有研究表明綠原酸對(duì)多種腐敗菌起到一定的抑制效果[7-8],但將其作為QSI研究其對(duì)腐敗菌致腐特性的影響卻鮮見(jiàn)報(bào)道。綠原酸作為新型植物源QSI與傳統(tǒng)的防腐劑相比,首先并不妨礙細(xì)菌的正常生長(zhǎng),僅在適當(dāng)濃度時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的QS系統(tǒng)起到調(diào)控作用,在避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的情況下抑制細(xì)菌腐敗因子的表達(dá),降低細(xì)菌的致腐能力。

致腐微生物的生長(zhǎng)是引起肉品腐敗變質(zhì)的關(guān)鍵因素,其中假單胞菌屬通常被鑒定為肉類(lèi)優(yōu)勢(shì)腐敗菌,假單胞菌在冷鮮肉中的生長(zhǎng)速率比其他細(xì)菌快三分之一左右[9-10]。熒光假單胞菌(P.fluorescens)為假單胞菌屬嗜冷革蘭氏陰性菌,是引起低溫條件下高蛋白和高脂肪食品腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌群[11]。細(xì)菌胞外蛋白酶、脂肪酶作為毒力因子在腐敗菌的侵染過(guò)程中起重要作用,可降解肉品中的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì),產(chǎn)生多種腐敗代謝產(chǎn)物,進(jìn)而使肉類(lèi)食品風(fēng)味和品質(zhì)發(fā)生腐敗變性。因此,通過(guò)干擾或阻斷腐敗菌之間的信息傳遞來(lái)抑制其致腐特性的表達(dá)成為肉品保鮮領(lǐng)域重要的研究課題。本文以P.fluorescens為研究對(duì)象,探究綠原酸在不抑制其正常生長(zhǎng)的條件下,對(duì)產(chǎn)生嗜鐵素、胞外蛋白酶、胞外脂肪酶、群集泳動(dòng)等致腐特性的抑制作用,以期拓寬綠原酸在肉品防腐保鮮方面的應(yīng)用范圍,為其作為天然群體感應(yīng)抑制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株:熒光假單胞菌(P.fluorescens) 由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所自主從冷鮮雞肉中分離得到;紫色桿菌Chromobacteriumviolaceum026(CV026) 培養(yǎng)時(shí)需添加卡那霉素 20 μg/mL,由本實(shí)驗(yàn)室保藏;綠原酸(杜仲提取物,98%) 陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司;蛋白酶活性檢測(cè)試劑盒 索萊寶公司;AHLs類(lèi)信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品(C4-HSL、C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、C10-HSL、3-oxo-C12-HSL、C12-HSL、C14-HSL) Sigma公司;無(wú)水甲醇(HPLC純) 國(guó)藥集團(tuán);脫脂乳粉、對(duì)硝基苯酚、對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯、Tris-HCl、鉻天青S(CAS)、十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA) 生工生物工程有限公司。

JY5002型電子天平 海良平儀器儀表有限公司;SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;UniCenMR臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Herolab公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng);SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng);Ⅱ-ZX-40高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析儀 美國(guó)Aglient公司;Gen5全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠原酸對(duì)P.fluorescens的最小抑菌濃度(MIC)及群體感應(yīng)抑制活性的檢測(cè) 將菌株P(guān).fluorescens過(guò)夜活化兩次后,按2%接種量接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后收集菌株,用磷酸鹽緩沖液(PBS)將細(xì)菌重懸至OD600為0.5,按2%(V/V)的比例將菌懸液加入到LB液體培養(yǎng)基中混勻。采用二倍稀釋法,向上述培養(yǎng)基中加入綠原酸使終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL,28 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定OD600,以抑制菌株生長(zhǎng)的最低綠原酸的質(zhì)量濃度為MIC。

報(bào)告菌株CV026過(guò)夜活化兩次,按2%的接種量接種于含有20 μg/mL卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中,于28 ℃搖床培養(yǎng)(180 r/min)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,按2%接種量接種于含有20 μg/mL C4-HSL信號(hào)分子的LB半固瓊脂培養(yǎng)基,混合均勻后倒平板,待培養(yǎng)基凝固后緩慢放入牛津杯,杯中加入200 μL 1.5 mg/mL的綠原酸,以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液作為空白對(duì)照,28 ℃培養(yǎng)24 h后觀(guān)察紫色素的產(chǎn)生情況。

1.2.2 綠原酸對(duì)P.fluorescens產(chǎn)信號(hào)分子AHLs的影響 AHLs粗提液的制備:活化后的P.fluorescens接種于LB液體培養(yǎng)基中,分別添加終濃度為1.5、2、2.5、3 mg/mL的綠原酸,以未添加綠原酸的液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。置于30 ℃搖床培養(yǎng)(200 r/min)12 h,12000 r/min、4 ℃離心20 min,取上清液,用等體積乙酸乙酯(含0.1 mL/L乙酸)萃取,吸出有機(jī)相,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干有機(jī)溶劑(35 ℃,真空度0.1 MPa),用甲醇充分潤(rùn)洗蒸發(fā)瓶,所得甲醇溶液即為AHLs粗提液,-20 ℃保存。

AHLs的檢測(cè):以甲醇為溶劑制備含有7種AHLs標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,由HPLC-MS檢測(cè)確定各AHLs的保留時(shí)間,參照馬晨晨等[12]的方法設(shè)置色譜、質(zhì)譜條件,將提取的AHLs粗提液做進(jìn)一步鑒定。色譜條件:Waters Sunfire C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,3.5 μm);流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:35 ℃;流動(dòng)相為甲醇∶水(50∶50,V/V)等梯度洗脫。質(zhì)譜條件:離子源溫度:120 ℃,脫溶劑溫度350 ℃;脫溶劑氣和錐孔氣N2,脫溶劑氣流速500 L/h,錐孔氣流速50 L/h;毛細(xì)管電壓3.5 kV。樣品經(jīng)C18色譜柱分離后進(jìn)入質(zhì)譜,采用電噴霧離子源正離子模式和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式,外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

1.2.3 綠原酸對(duì)P.fluorescens生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響 過(guò)夜活化得到的指示菌株按2%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中,分別添加終濃度為1.5、2、2.5、3 mg/mL的綠原酸,設(shè)置未添加綠原酸的液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組,添加C4-HSL信號(hào)分子為陽(yáng)性對(duì)照組。將菌液置于28 ℃條件下200 r/min搖床培養(yǎng),每隔1 h測(cè)定其OD600值,記錄并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.4 綠原酸對(duì)P.fluorescens腐敗特性的影響

1.2.4.1 CASAD嗜鐵素平板法檢測(cè)嗜鐵素含量 無(wú)菌上清液處理方法:將過(guò)夜活化的P.fluorescens菌株接種至含有不同濃度綠原酸(1.5、2、2.5、3 mg/mL)和添加外源C4-HSL信號(hào)分子(2 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中,于28 ℃,200 r/min培養(yǎng)24 h后,4 ℃,12000 r/min離心2 min,吸取上清液并用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌備用。

嗜鐵素檢測(cè)平板配制參照參考文獻(xiàn)[13],待固體培養(yǎng)基凝固后緩慢放入牛津杯,每孔加入培養(yǎng)液上清200 μL,28 ℃培養(yǎng)24 h后觀(guān)察。由于嗜鐵素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合培養(yǎng)基中的鐵,使杯周?chē)呐囵B(yǎng)基由原來(lái)的藍(lán)色變成黃色,黃色暈圈的大小代表菌株分泌嗜鐵素的含量。

1.2.4.2 綠原酸對(duì)P.fluorescens胞外蛋白酶活性的影響 本研究蛋白酶活性定性檢測(cè)參照文獻(xiàn)采用牛奶平板法[14],并稍做修改。本研究蛋白酶活性的定量檢測(cè)使用堿性蛋白酶試劑盒。

牛奶平板法:15%的脫脂乳粉用純水溶解后單獨(dú)滅菌(115 ℃,30 min),取10 mL脫脂乳與90 mL含0.85%瓊脂的LB半固態(tài)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基混合均勻,傾注到水瓊脂平板中。待培養(yǎng)基凝固后緩慢放入牛津杯,每孔加入菌液上清200 μL,28 ℃靜置培養(yǎng)24 h后觀(guān)察其水解圈直徑,設(shè)置未添加綠原酸的液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組,添加C4-HSL信號(hào)分子為陽(yáng)性對(duì)照組。

蛋白酶含量測(cè)定:參照1.2.4.1方法制備菌液上清并過(guò)濾除菌,根據(jù)堿性蛋白酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,測(cè)定680 nm處吸光度,按照蛋白濃度計(jì)算蛋白酶活性。

1.2.4.3 綠原酸對(duì)P.fluorescens胞外脂肪酶活性的影響 采用對(duì)硝基苯酚(p-NP)法進(jìn)行脂肪酶活性的定量檢測(cè)[15],取90 mg對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPO)溶解于30 mL乙腈溶液中,作為底物溶液存于-20 ℃?zhèn)溆?。?00 μL底物溶液加入900 μL 50 mmol/L的Tris-HCL緩沖液(pH8.0)中,搖勻后于37 ℃保溫5 min,然后向其加入50 μL適當(dāng)稀釋的脂肪酶待測(cè)樣品,設(shè)置相應(yīng)體積的滅活樣品作為空白對(duì)照,37 ℃振蕩反應(yīng)5 min。反應(yīng)結(jié)束后,立即加入300 μL 10%的三氯乙酸中止反應(yīng),搖勻后靜置5 min,加入300 μL 10% Na2CO3溶液,搖勻,于4 ℃,13500 r/min離心2 min,取反應(yīng)液測(cè)定OD410值。1個(gè)酶活單位定義為:在37 ℃條件下,每分鐘水解p-NPO釋放1 μmol p-NP所需的酶量,以U表示。計(jì)算脂肪酶活性公式如下:

式中:X為脂肪酶活性,U·mL-1;c為p-NP濃度,μmol·mL-1;V為終止后總體積,mL;v為酶液用量,mL;t為反應(yīng)時(shí)間,min。

1.2.4.4 綠原酸對(duì)P.fluorescens群集運(yùn)動(dòng)和泳動(dòng)的影響 參照文獻(xiàn)[16]配制群集瓊脂培養(yǎng)基(1%蛋白胨(質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì),下同)、0.5%氯化鈉、0.5%瓊脂和0.5%葡萄糖)和泳動(dòng)瓊脂培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨、0.5%氯化鈉、0.3%瓊脂),將不同濃度的綠原酸經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌后,與冷卻至40 ℃的群集泳動(dòng)瓊脂培養(yǎng)基混勻,倒平板,使平板中綠原酸的終濃度為1.5、2、2.5、3 mg/mL,設(shè)置未添加綠原酸的液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組,添加C4-HSL信號(hào)分子為陽(yáng)性對(duì)照組。向冷卻的平板中央加入5 μL過(guò)夜活化的P.fluorescens菌液,無(wú)菌風(fēng)吹干后28 ℃靜置培養(yǎng)24 h,觀(guān)察供試菌株的遷移情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行并重復(fù)操作三次,結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n≥3),利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用最小顯著差異法(LSD)分析均值的差異性,顯著性水平為0.05。使用分析軟件Origin 8.5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸的最小抑菌濃度及QSIs活性

采用二倍稀釋法觀(guān)察綠原酸濃度梯度為0.625～10 mg/mL時(shí)P.fluorescens和CV026菌株的生長(zhǎng)情況,確定了綠原酸對(duì)P.fluorescens和CV026菌株的最小抑菌濃度均為5 mg/mL。因此,為保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)效果非綠原酸本身的抑菌作用,綠原酸濃度均設(shè)置為亞抑菌濃度[17],即1.5、2、2.5、3 mg/mL。

圖1表示在亞抑菌劑量下綠原酸對(duì)紫色桿菌CV026 QS活性的影響。紫色桿菌CV026紫色素的產(chǎn)生受其群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控,當(dāng)存在信號(hào)分子時(shí),其群體感應(yīng)系統(tǒng)被激發(fā),產(chǎn)生紫色表型[17];若樣品中含有群體感應(yīng)抑制劑,則會(huì)抑制CV026產(chǎn)生紫色素的能力。圖1顯示,加入綠原酸的牛津杯周?chē)霈F(xiàn)渾濁、不透明的抑制圈,表明綠原酸在不影響菌株生長(zhǎng)的情況下,具有抑制CV026群體感應(yīng)活性的能力。

圖1 綠原酸對(duì)紫色桿菌CV026紫色素產(chǎn)生的抑制作用Fig.1 Effect of hlorogenic acid on violacein production of CV026注:1:2.5 mg/mL綠原酸;2:50%甲醇溶液。

2.2 綠原酸對(duì)P. fluorescens產(chǎn)AHLs的影響

2.2.1 HPLC-MS/MS檢測(cè)AHLs標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC-MS/MS在所述條件下分別對(duì)7種AHLs信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè),得到AHLs混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖(圖2)?？梢钥闯龇宸蛛x良好,C4-HSL、C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、C10-HSL、3-oxo-C12-HSL、C12-HSL、C14-HSL標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間分別為1.009、1.922、2.421、4.808、4.904、5.306和5.928 min。

圖2 AHLs混合標(biāo)準(zhǔn)品離子流圖Fig.2 Chromatograms of mixture of AHLs

2.2.2P.fluorescens釋放AHLs的檢測(cè)P.fluorescens所產(chǎn)生信號(hào)分子的種類(lèi)為:C4-HSL、C6-HSL、C10-HSL、C12-HSL和3-oxo-C8-HSL。各類(lèi)信號(hào)分子的質(zhì)量濃度見(jiàn)表1,熒光假單胞菌分泌量較高的信號(hào)分子為C4-HSL和C6-HSL。與空白組相比,經(jīng)綠原酸處理的實(shí)驗(yàn)組釋放AHLs的種類(lèi)未發(fā)生明顯變化,但隨著綠原酸濃度的增加,各AHLs質(zhì)量濃度明顯下降,提示綠原酸能夠抑制P.fluorescens群體感應(yīng)信號(hào)分子的表達(dá)或釋放,可能是抑制了信號(hào)分子合成酶基因(LuxR/LuxI)的表達(dá),使AHLs的催化合成釋放減少。

表1 熒光假單胞菌AHLs信號(hào)分子水平(μg/L)Table1 The AHLs level of P. fluorescens(μg/L)

2.3 綠原酸對(duì)P. fluorescens生長(zhǎng)曲線(xiàn)影響

對(duì)生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行測(cè)定能夠更加深入地觀(guān)察菌株的生長(zhǎng)情況。由圖3可知,低于3 mg/mL綠原酸濃度處理的P.fluorescens與對(duì)照組的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致,0～2 h為細(xì)菌生長(zhǎng)的遲緩期,2 h后開(kāi)始進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,經(jīng)綠原酸處理的菌株生長(zhǎng)稍緩于C4-HSL處理組和空白對(duì)照組,至12 h菌株生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定,此時(shí)C4-HSL處理組的OD600值為1.40,空白對(duì)照組為1.41,添加1.5、2、2.5 mg/mL綠原酸的處理組OD600值分別為1.35、1.37、1.36,與空白對(duì)照組幾乎保持一致,菌株的生長(zhǎng)水平并沒(méi)有受到明顯影響。而經(jīng)3 mg/mL綠原酸處理的P.fluorescens生長(zhǎng)明顯放緩,于3～4 h后開(kāi)始進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,在12 h時(shí)其菌體密度OD600為1.28。上述結(jié)果表明濃度低于3 mg/mL的綠原酸不影響P.fluorescens的生長(zhǎng),濃度到達(dá)3 mg/mL時(shí)能一定程度減緩P.fluorescens生長(zhǎng),但對(duì)最終的菌體濃度未造成顯著影響(P>0.05)。

圖3 綠原酸對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響Fig.3 Effect of chlorogenic acid on the growth curve of P. fluorescens

2.4 綠原酸對(duì)P. fluorescens腐敗特性的影響

2.4.1 綠原酸對(duì)P.fluorescens嗜鐵素產(chǎn)生的影響 嗜鐵素的產(chǎn)生是腐敗細(xì)菌拮抗競(jìng)爭(zhēng)的一種方式[18],其作為P.fluorescens成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌的重要因子,主要通過(guò)對(duì)鐵離子的競(jìng)爭(zhēng)影響其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。熒光假單胞菌產(chǎn)生的嗜鐵素絡(luò)合食品基質(zhì)中的鐵離子,使其他微生物得不到足夠的鐵營(yíng)養(yǎng),生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制,從而使其能夠維持自身的菌體密度[19]。李婷婷等[3]發(fā)現(xiàn)AHLs對(duì)溫和氣單胞菌嗜鐵素產(chǎn)生具有調(diào)控作用。Stintzi等[20]報(bào)道了銅綠假單胞菌通過(guò)QS調(diào)控嗜鐵素的產(chǎn)生量。CASAD嗜鐵素平板法檢測(cè)P.fluorescens嗜鐵素暈圈,結(jié)果如圖4所示。相比對(duì)照組,添加外源C4-HSL時(shí)嗜鐵素水解圈直徑明顯增大,表示嗜鐵素生成量增多,而綠原酸處理組嗜鐵素的生成量明顯降低,且呈濃度效應(yīng)關(guān)系。這表明綠原酸可能通過(guò)干擾P.fluorescens由AHLs介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)有效抑制嗜鐵素的產(chǎn)生,進(jìn)而降低其致腐能力。

圖4 C4-HSL和綠原酸對(duì)熒光假單胞菌嗜鐵素產(chǎn)生的影響Fig.4 Effect of chlorogenic acid on the siderophore production of C4-HSL and P. fluorescens 注:1:C4-HSL;2:對(duì)照;3:1.5 mg/mL;4:2 mg/mL;5:2.5 mg/mL;6:3 mg/mL。

2.4.2 綠原酸對(duì)P.fluorescens蛋白酶活性的影響P.fluorescens是肉產(chǎn)品中主要的蛋白分解菌,具有產(chǎn)生高活性蛋白水解酶的能力[21]。其致腐機(jī)理是利用蛋白酶降解肉品中蛋白質(zhì),促進(jìn)自身生長(zhǎng)繁殖,同時(shí)產(chǎn)生異味和揮發(fā)性鹽基氮并使肉軟化,導(dǎo)致肉品風(fēng)味和品質(zhì)發(fā)生劣變,甚至產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)[22]。本文探究不同濃度綠原酸對(duì)P.fluorescens胞外蛋白酶活性的抑制作用,結(jié)果如圖5所示。與未添加綠原酸處理的對(duì)照組相比,C4-HSL處理組水解圈直徑更大,經(jīng)綠原酸處理后蛋白酶水解圈直徑明顯減小,且水解圈直徑與綠原酸濃度呈負(fù)相關(guān)。

圖5 C4-HSL和綠原酸對(duì)熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的影響Fig.5 The effects of C4-HSL and chlorogenic acid on extracellular protease activity of P. fluorescens注：1：C4-HSL；2：對(duì)照；3：1.5 mg/mL；4：2 mg/mL；5：2.5 mg/mL；6：3 mg/mL。

相關(guān)研究表明,細(xì)菌蛋白酶的分泌受到QS系統(tǒng)的調(diào)控[6],且通過(guò)添加姜油酮[23]、富馬酸鈉[24]等QSI發(fā)現(xiàn),細(xì)菌胞外蛋白酶分泌量明顯降低。牛奶平板法能初步定性顯示蛋白酶的含量,為了定量細(xì)菌所產(chǎn)胞外蛋白酶,進(jìn)一步確定受AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)是否參與調(diào)控P.fluorescens胞外蛋白酶的分泌,探究不同濃度綠原酸對(duì)P.fluorescens胞外蛋白酶活性的影響,采用蛋白酶試劑盒法檢測(cè)蛋白酶活性。結(jié)果如圖6所示,經(jīng)外源C4-HSL誘導(dǎo)的細(xì)菌菌液上清中蛋白酶活性顯著高于包括空白組在內(nèi)的其他處理組(P<0.05),高達(dá)0.834 U/mg prot,提示QS系統(tǒng)參與調(diào)控其胞外蛋白酶的產(chǎn)生。且隨著添加綠原酸濃度的升高,P.fluorescens胞外蛋白酶活性逐漸降低,除2和2.5 mg/mL綠原酸處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義之外(P>0.05),其余綠原酸處理組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。綠原酸濃度為3 mg/mL時(shí),胞外蛋白酶活性降低為0.26 U/mg prot。表明綠原酸可通過(guò)干擾AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)來(lái)抑制P.fluorescens胞外蛋白酶活性,且濃度越高,抑制作用越強(qiáng)。

圖6 C4-HSL和綠原酸對(duì)熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的影響Fig.6 The effect of C4-HSL and chlorogenic acid on extracellular protease activity of P. fluorescens注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7同。

2.4.3 綠原酸對(duì)P.fluorescens脂肪酶活性影響 肉品中的腐敗菌能產(chǎn)生降解肌肉組織的脂肪酶,將甘油三酯降解為甘油或脂肪酸,從而改變禽畜肉組織結(jié)構(gòu)導(dǎo)致腐敗。脂肪酶活性可能受到由AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)參與調(diào)控,為探究不同濃度綠原酸對(duì)P.fluorescens胞外脂肪酶活性的影響,采用p-NPP比色法測(cè)定不同處理菌株的脂肪酶活性,結(jié)果由圖7可知。通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)C4-HSL存在時(shí)脂肪酶活性最高,達(dá)0.49 U/mL,其余實(shí)驗(yàn)組酶活性均顯著低于C4-HSL處理組(P<0.05),提示其胞外脂肪酶的產(chǎn)生受到QS系統(tǒng)影響。各濃度綠原酸處理組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中經(jīng)3 mg/mL綠原酸處理后P.fluorescens酶活性最低,僅為0.074 U/mL。說(shuō)明綠原酸能明顯抑制熒光假單胞菌胞外脂肪酶活性,且濃度越高,抑制作用明顯。研究中發(fā)現(xiàn)P.fluorescens脂肪酶活性普遍偏低,可能與培養(yǎng)基和發(fā)酵等培養(yǎng)條件相關(guān);其次有研究表明細(xì)菌脂肪酶的分泌需要同源分泌系統(tǒng),但細(xì)菌脂肪酶基因一般受到嚴(yán)格的表達(dá)調(diào)控,其機(jī)制和途徑復(fù)雜,導(dǎo)致細(xì)菌脂肪酶(特別是假單胞菌屬脂肪酶)產(chǎn)量普遍不高[25]。

圖7 C4-HSL和綠原酸對(duì)熒光假單胞菌胞外脂肪酶活性的影響Fig.7 The effect of C4-HSL and chlorogenic acid on extracellular lipase activity of P. fluorescens

2.4.4 綠原酸對(duì)P.fluorescens群集與泳動(dòng)的影響 群集和泳動(dòng)作為細(xì)菌的兩種遷移方式,其區(qū)別在于前者是群體行為,指細(xì)菌在大于0.45%的瓊脂培養(yǎng)基上的表面遷移,后者則是一種個(gè)體行為,指細(xì)菌在小于0.45%的瓊脂培養(yǎng)基表面遷移[26-27]。細(xì)菌鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)特性在定殖到宿主表面及后續(xù)生物被膜形成過(guò)程中起到重要作用[28]。細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性被證實(shí)在定植到宿主表面后菌體聚集導(dǎo)致微菌落及后繼形成生物膜的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[29]。圖8、圖9為不同濃度下綠原酸對(duì)P.fluorescens群集與泳動(dòng)的抑制效果圖。由圖8、圖9可以看出,添加C4-HSL的處理組菌株運(yùn)動(dòng)能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組和其他任何濃度綠原酸處理的菌株,其群集與泳動(dòng)直徑分別為27.26、30.10 mm,進(jìn)一步說(shuō)明了AHLs可調(diào)控P.fluorescens的運(yùn)動(dòng)能力,而經(jīng)綠原酸處理后熒光假單胞菌的運(yùn)動(dòng)性受到明顯的抑制,且P.fluorescens群集和泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)特性與綠原酸的添加量呈負(fù)相關(guān)。表明P.fluorescens運(yùn)動(dòng)能力受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控,且綠原酸可能干擾了熒光假單胞菌鞭毛粘附至接觸面的能力[28],進(jìn)而影響其致腐能力。

圖8 C4-HSL和綠原酸對(duì)熒光假單胞菌群集(a)和泳動(dòng)(b)的影響Fig.8 The effects of C4-HSL and chlorogenic acid on swarming and swimming of P. fluorescens注：1：C4-HSL；2：對(duì)照；3：1.5 mg/mL；4：2 mg/mL；5：2.5 mg/mL；6：3 mg/mL。

圖9 C4-HSL和綠原酸對(duì)熒光假單胞菌運(yùn)動(dòng)區(qū)直徑和面積的影響Fig.9 The effect of C4-HSL and chlorogenic acid on diameter and area of the motility zone of P. fluorescens

3 結(jié)論

利用紫色桿菌CV026檢測(cè)模型證明了綠原酸具有群體感應(yīng)抑制活性;綠原酸在不影響P.fluorescens正常生長(zhǎng)的條件下明顯抑制了P.fluorescens與腐敗相關(guān)的生物特性。P.fluorescens這些腐敗特性的表達(dá)均受由信號(hào)分子介導(dǎo)的QS的調(diào)控,當(dāng)添加3 mg/mL以下亞抑菌濃度的綠原酸時(shí),嗜鐵素、蛋白酶活性、脂肪酶活性、群集和泳動(dòng)能力均受到明顯的抑制,且隨著綠原酸濃度的增加,抑制效果更趨明顯。此外,HPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果表明,綠原酸能夠有效降低P.fluorescensAHLs的釋放。因此推測(cè)綠原酸可能通過(guò)降解P.fluorescens信號(hào)分子的方式來(lái)阻斷P.fluorescens的群體感應(yīng)系統(tǒng),從而減弱其腐敗特性的表達(dá),證實(shí)了綠原酸良好的群體感應(yīng)抑制活性,但對(duì)其調(diào)節(jié)細(xì)菌AHLs的分泌進(jìn)而抑制致腐能力的分子機(jī)制尚未明了,因此可以進(jìn)一步解析綠原酸對(duì)腐敗菌QS系統(tǒng)的調(diào)控靶點(diǎn)及作用方式,為其作為新型QSIs的開(kāi)發(fā)提供理論支撐,促進(jìn)其在食品防腐保鮮中發(fā)揮優(yōu)勢(shì)作用。