裴若楠，翟紅蕾，戚勃，郝淑賢，黃卉，楊賢慶*

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510300) 2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

石花菜(Gelidiumamansii)又名海凍菜、雞毛菜，是一種石花菜科(Gelidiaceae)石花菜屬(Gelidium)的海洋經(jīng)濟(jì)紅藻，在日本、韓國(guó)以及我國(guó)自北到南沿海地帶均有分布[1-3]。作為提取瓊膠的主要原料之一，石花菜在醫(yī)藥、生物研究、水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品、化妝品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[4-6]。多糖是石花菜中含量最高的成分，也是石花菜中具有重要生物活性的主成分之一，相關(guān)研究表明[7-10]，石花菜多糖在降血脂、降血糖、抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等方面效果顯著。目前，國(guó)內(nèi)外研究石花菜多糖生物活性的報(bào)道較多，但多數(shù)研究未對(duì)石花菜多糖進(jìn)行分離純化，仍保留了大量蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)[11-13]。為了更深層次解析石花菜多糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)及生物活性，對(duì)所提粗多糖進(jìn)行分離純化的研究必不可少。

實(shí)驗(yàn)室前期已對(duì)石花菜多糖的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，本研究以石花菜為原料，采用優(yōu)化的復(fù)合酶法提取工藝對(duì)石花菜多糖進(jìn)行提取，利用Sevage法對(duì)粗多糖中的蛋白質(zhì)進(jìn)行脫除，進(jìn)一步應(yīng)用DEAE-52纖維素陰離子交換柱聯(lián)合Sephadex G-200凝膠過(guò)濾層析對(duì)所得多糖進(jìn)行分離純化，對(duì)所得高純度多糖的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，并通過(guò)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP)對(duì)多糖進(jìn)行柱前衍生化處理，采用高效液相色譜技術(shù)對(duì)其單糖組成進(jìn)行了測(cè)定，以期為石花菜多糖結(jié)構(gòu)解析及功能性產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)提供初步理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石花菜(Gelidiumamansii)，產(chǎn)自山東威海。

DEAE-52纖維素、Sephadex G-200,合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；纖維素酶(酶活性≥30 U/mg)、木瓜蛋白酶(酶活性≥2.0×105U/mg),廣州領(lǐng)馭生物科技有限公司。

14種單糖標(biāo)準(zhǔn)品：D(+)-葡萄糖(glucose, Glu)、D-甘露糖(mannose, Man)、L-鼠李糖(rhamnose, Rha)、D-半乳糖(galactose, Gal)、D-阿拉伯糖(arabinose, Arb)、L(-)-巖藻糖(fucose, Fuc)、木糖(xylose, Xyl)、核糖(ribose, Rib)、氨基葡萄糖(glucosamine, GlcN)、氨基半乳糖(galactosamine, GalN)、古洛糖醛酸(guluronic acid, G)、甘露糖醛酸(mannuronic acid, M)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid, GlcUA)、半乳糖醛酸(galacturonic acid, GalUA)，均購(gòu)自廣州領(lǐng)馭生物科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP)、無(wú)水乙醇、NaCl、苯酚、濃H2SO4、濃HCl、氯仿、正丁醇、三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)、Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；乙腈為國(guó)產(chǎn)色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；EYELAN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會(huì)社；Alphal-4冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；SUNRISE吸光酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；3K30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器，金壇市精達(dá)儀器制造廠；Agilent 1100液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司；N-EVAP24氮吹儀，美國(guó)ORGANOMATION公司；IRAffinity-1紅外光譜儀，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 石花菜粗多糖的提取工藝流程

將石花菜干藻用自來(lái)水浸泡、反復(fù)沖洗以去除砂礫及貝殼等雜質(zhì)，洗凈后的石花菜自然晾曬一段時(shí)間后置于55 ℃恒溫干燥箱中鼓風(fēng)烘干，干燥后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80目篩，以無(wú)水乙醇作為溶劑，置于恒溫振蕩器中8 h進(jìn)行脫脂操作。在復(fù)合酶[m(木瓜蛋白酶)∶m(纖維素酶)=2∶1]添加量23 g/L、酶解溫度60.5 ℃、料液比1∶32(g∶mL)條件下提取2 h，沸水處理10 min滅酶活力，4 500 r/min離心15 min，取上清液于60 ℃旋蒸濃縮。取濃縮糖液加入1/4體積的Sevage試劑[V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1]，置于振蕩器中振蕩30 min以脫蛋白，7 500 r/min離心15 min，取上清液重復(fù)上述操作至無(wú)蛋白沉淀層，離心，取上清液以超純水透析48 h，每隔4 h換水1次，再將透析液旋蒸濃縮至約原體積1/4，加入4倍體積的無(wú)水乙醇醇沉過(guò)夜，7 500 r/min離心15 min，取沉淀進(jìn)行冷凍干燥，即得石花菜粗多糖，備用。

1.3.2 石花菜多糖的分離純化

1.3.2.1 DEAE-52陰離子交換柱層析

將DEAE-52填料活化后采用濕法裝柱(1.6 cm×30 cm)，以3倍柱體積的超純水進(jìn)行平衡。取脫蛋白凍干后的粗多糖樣品100 mg加入20 mL超純水溶解，上樣DEAE-52纖維素柱進(jìn)行分離純化，按順序依次以超純水及濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，每5 mL收集1管，每個(gè)梯度收集60管，以苯酚-H2SO4法[14]隔管檢測(cè)洗脫液在490 nm處的吸光度，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線選取最佳洗脫峰段，按峰對(duì)洗脫液進(jìn)行合并收集，濃縮后經(jīng)10 000 D透析袋透析48 h，冷凍干燥備用[15]。

1.3.2.2 Sephadex G-200凝膠柱層析

將經(jīng)DEAE-52離子交換柱分離純化得到的組分GAP1用超純水溶解，上樣于平衡好的Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱(1.6 cm×50 cm)，以超純水進(jìn)行洗脫，每5 mL收集1管，采用苯酚-H2SO4法逐管檢測(cè)洗脫液在490 nm處吸光度，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。根據(jù)所得洗脫曲線收集主要峰段洗脫液，旋蒸濃縮后冷凍干燥，得精制石花菜多糖。

1.3.3 石花菜多糖單糖組成分析

采用PMP柱前衍生高效液相色譜法[16-19]。

14種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)液配制：各單糖的質(zhì)量濃度均為0.2 mg/mL，置于4 ℃冰箱中備用，使用時(shí)先與0.6 mol/L的NaOH溶液按照體積比1∶1混合后再進(jìn)行衍生化處理。

待測(cè)樣品前處理：取GAP1干燥粉末10.0 mg于離心管中，加入2 mL TFA(2 mol/L)，105 ℃條件下水解4 h，氮?dú)獯蹈?，用甲醇洗滌以除去殘留的TFA，再以氮?dú)獯蹈?，重?fù)上述操作2次，最后在干燥樣品中加超純水定容至10 mL，得1.0 mg/mL的樣品水解液備用。

PMP衍生化處理：分別取單糖混合標(biāo)準(zhǔn)液及多糖樣品水解液各500 μL于試管中，分別加入500 μL NaOH溶液(0.3 mol/L)，渦旋30 s后加入500 μL PMP-甲醇(0.5 mol/L)，置于水浴鍋中80 ℃水浴1 h，待冷卻后加入500 μL HCl(0.3 mol/L)，混勻后再加入1 mL氯仿渦旋30 s，8 000 r/min離心10 min，吸棄氯仿層，重復(fù)上述操作3次，上清液過(guò)0.22 μm濾膜，置于4 ℃條件下備用。

色譜條件：色譜柱：Great smart RP18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A相為0.1 mol/L pH 6.85磷酸鹽緩沖液，B相為甲醇，C相為乙腈；梯度洗脫程序：0～9 min，83.0%A、0%B、17.0%C；9～26 min，78%A、0%B、22%C；26～32 min，40%A、0%B、60%C；32～36 min，86%A、0%B、14%C；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；波長(zhǎng)：250 nm。

1.3.4 石花菜多糖理化性質(zhì)分析

1.3.4.1 總糖含量測(cè)定

采用苯酚-H2SO4法測(cè)定粗多糖、脫蛋白多糖及GAP1的總糖含量。

1.3.4.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用南京建成公司提供的BCA法蛋白濃度定量試劑盒，測(cè)定粗多糖、脫蛋白多糖及GAP1的蛋白質(zhì)含量。

1.3.4.3 糖醛酸含量測(cè)定

參照王文平等[20]的方法，采用H2SO4-咔唑法對(duì)粗多糖、脫蛋白多糖及GAP1中糖醛酸含量進(jìn)行測(cè)定，方法略有改動(dòng)：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別精確吸取半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液(0.1 mg/mL)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL具塞試管中，各加水至1 mL；在冰水浴中向各管加入5 mL的硼砂-H2SO4溶液(0.956 g硼砂溶于200 mL濃H2SO4)，混勻后沸水浴中加熱5 min，取出后冷卻至室溫；再加入0.1%咔唑溶液0.2 mL，渦旋30 s，沸水浴5 min，冷卻測(cè)定各管在523 nm處的吸光度。由所得結(jié)果建立糖醛酸質(zhì)量濃度(μg/mL)和吸光度的線性回歸方程為：y=0.007 3x+0.028 9，R2=0.994 9。

多糖樣品中糖醛酸含量測(cè)定：取適量粗多糖、脫蛋白多糖及GAP1配制成0.1 mg/mL的樣品液，按照相同方法測(cè)定各樣品液在523 nm處的吸光度。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算糖醛酸含量。

1.3.4.4 硫酸基含量測(cè)定

參照宮春宇等[21]的方法，采用BaSO4比濁法測(cè)定硫酸基含量，方法略有改動(dòng)：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取適量K2SO4干燥至恒重，精密稱取108.75 mg，以1 moL/L的HCl溶解定容至100 mL，配制成0.6 mg/mL的硫酸基標(biāo)準(zhǔn)液，置于4 ℃冰箱中備用。

分別吸取0、0.04、0.08、0.12、0.16及0.20 mL標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，加入適量1 moL/L的HCl溶液補(bǔ)至0.2 mL，以HCl溶液作為空白，每管分別加入3.8 mL三氯乙酸及1 mL BaCl2-明膠溶液(稱取1 g BaCl2以0.5%的明膠溶液定容至100 mL，4 ℃冰箱備用)，置于室溫下靜置15 min，于360 nm測(cè)定吸光度，記為A1；用1.0 mL明膠溶液代替BaCl2，同法測(cè)吸光度，記為A2；以硫酸基質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)，吸光度差值A(chǔ)1-A2為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由所得結(jié)果建立硫酸基質(zhì)量(mg)和吸光度差值的線性回歸方程為y=1.749 4x+0.021 8，R2=0.993 8。

多糖樣品硫酸基含量測(cè)定：分別取50 mg石花菜粗多糖、脫蛋白多糖及GAP1于具塞試管中，加入1 mol/L的HCl溶液10 mL，混勻后置于100℃水浴鍋中水解4 h，待水解液冷卻后加入適量HCl溶液定容至50 mL，用濾紙過(guò)濾除去不溶物質(zhì)，即得1 mg/mL的樣品待測(cè)液。以同樣方法測(cè)定吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品液中硫酸基含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEAE-52陰離子交換柱層析結(jié)果

通過(guò)DEAE-52離子交換層析柱對(duì)石花菜多糖進(jìn)行分離純化，利用苯酚-H2SO4法測(cè)定洗脫液490 nm處吸光值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線如圖1所示。

圖1 石花菜多糖DEAE-52離子交換柱層析洗脫曲線

從圖1中可以看出，石花菜多糖在經(jīng)DEAE-52分離后出現(xiàn)4個(gè)較為明顯的吸收峰，分別為超純水洗脫組分、0.1 mol/L NaCl洗脫組分、0.3 mol/L NaCl洗脫組分、0.5 mol/L NaCl洗脫組分，其中以0.3 mol/L NaCl洗脫組分含量最高，將其主峰組分收集，命名為GAP1，冷凍干燥后備用。

2.2 Sephadex G-200凝膠柱層析結(jié)果

取干燥后的GAP1組分10 mg，加超純水配制成5 mg/mL的多糖樣品液上樣于Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱，以超純水洗脫，每5 mL收集1管，每組分收集30管，苯酚-H2SO4法檢測(cè)每管的多糖含量，繪制洗脫曲線如圖2所示。由圖2可知，GAP1組分在經(jīng)Sephadex G-200凝膠柱后呈現(xiàn)單一對(duì)稱的洗脫峰，表明GAP1為單一組分多糖，將主峰組分合并濃縮，冷凍干燥后得白色絮狀精制多糖。

圖2 GAP1在Sephadex G-200凝膠柱中的洗脫曲線

2.3 石花菜多糖的化學(xué)組分分析結(jié)果

由表1可看出，提取得到的石花菜粗多糖、脫蛋白多糖以及純化后的精制多糖GAP1都為酸性多糖，硫酸基含量及糖醛酸含量都比較高。石花菜多糖在脫蛋白后總糖含量、糖醛酸含量以及硫酸基含量都有一定程度的增加，其中總糖含量增加明顯；蛋白質(zhì)含量明顯降低，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)85.35%，說(shuō)明Sevage脫蛋白法效果良好；在經(jīng)DEAE-52及Sephadex G-200分離純化后，精制石花菜多糖GAP1中糖醛酸含量和硫酸基含量進(jìn)一步增加，總糖含量可達(dá)92.56%，且未檢出蛋白質(zhì)，進(jìn)一步說(shuō)明了分離純化操作可更好的去除蛋白質(zhì)及各種小分子物質(zhì)，從而提高多糖的純度。

表1 石花菜多糖的化學(xué)組分分析 單位：%

注：“—”表示該物質(zhì)未檢出

2.4 石花菜多糖的化學(xué)組分分析結(jié)果

由于單糖本身缺乏生色基團(tuán)，不同單糖之間在結(jié)構(gòu)上又具有一定的相似性，故而通過(guò)常規(guī)的HPLC檢測(cè)方法很難對(duì)糖類物質(zhì)進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)[22-23]，為提高檢測(cè)的靈敏度，研究者通常會(huì)選擇對(duì)糖類物質(zhì)進(jìn)行柱前衍生化處理，使其變?yōu)榫哂休^強(qiáng)紫外吸收的物質(zhì)，再經(jīng)色譜柱進(jìn)行分離，其中PMP柱前衍生化高效液相色譜法因其具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確高效、耗時(shí)短的特點(diǎn)得到廣泛的應(yīng)用[24-26]。

采用PMP柱前衍生化高效液相色譜法對(duì)GAP1的單糖組成進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3、圖4所示，在保留時(shí)間8.863～10.571 min之間為PMP峰。

1-古洛糖醛酸；2-甘露糖醛酸；3-Man；4-Rib；5-Rha；6-GlcN；7-GlcUA；8-GalUA；9-GalN；10-Glu；11-Gal；12-Xyl；13-Arb；14-Fuc(下同)

圖4 GAP1的高效液相色譜圖

由圖3可得各標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間依次為：古洛糖醛酸 11.220 min，甘露糖醛酸 11.672 min，Man 12.813 min，Rib 14.754 min，Rha 15109 min，GlcN 16.011 min，GlcUA 17.339 min，GalUA 18.620 min，GalN 19.747 min，Glu 20.358 min，Gal 21.797 min，Xyl 22.283 min，Arb 22.658 min，F(xiàn)uc 24.203 min；從圖4分析可知，GAP1的高效液相色譜圖中顯示出的峰分別對(duì)應(yīng)單糖標(biāo)準(zhǔn)品峰5、7、10、11、12、14，表明GAP1主要是由鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和L-巖藻糖組成，其中以半乳糖含量最高，各單糖物質(zhì)的量比為1.00∶1.00∶4.45∶27.31∶2.27∶1.88。KANG等[12]對(duì)石花菜熱水提取物(碳水化合物含量68.54%)中單糖組成進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示半乳糖是其水溶性多糖中的主要單糖組分，占其物質(zhì)的量的86.0%，其次還含有巖藻糖(8.3%)、甘露糖(1.5%)、木糖(1.1%)、鼠李糖和葡萄糖(<1%)及少量葡萄糖醛酸(2.0%)，與本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果在單糖組成類型上是一致的，在單糖組成比例上存在一些差異，可能是多糖的提取純化方法、單糖測(cè)定方法不同造成的；CUI等[8]采用GC-MS分析方法，對(duì)石花菜同屬的大石花菜(GelidiumpacificumOkamura)純化多糖GPOP-1的單糖組成進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，大石花菜純化多糖GPOP-1主要單糖組成為7.1%木糖、59.7%半乳糖、19.76%半乳糖醛酸，與本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果相比，二者單糖組成不完全相同，但二者單糖含量最高的組分都是半乳糖。

3 結(jié)論

石花菜粗多糖經(jīng)過(guò)復(fù)合酶法提取、多糖溶液加入Sevage試劑[V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1]脫蛋白后，再依次經(jīng)過(guò)DEAE-52陰離子交換柱、Sephadex G-200凝膠柱進(jìn)行分離，苯酚-H2SO4法對(duì)多糖含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)主要的洗脫峰進(jìn)行收集，得單一組分GAP1。理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果顯示：GAP1多糖總糖含量為92.56%，不含蛋白質(zhì)，糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.93%，硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.92%，由此結(jié)果可以說(shuō)明，采用DEAE-52陰離子交換柱層析結(jié)合Sephadex G-200凝膠柱層析的方法可對(duì)石花菜多糖起到良好的分離純化效果。將GAP1組分進(jìn)行PMP衍生化處理，采用HPLC對(duì)多糖衍生物進(jìn)行分析，通過(guò)與混標(biāo)的單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖進(jìn)行對(duì)比分析得出結(jié)論，GAP1主要是由鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和L-巖藻糖6種單糖按照不同比例縮合而成，其中以半乳糖含量最高，各單糖物質(zhì)的量比為1.00∶1.00∶4.45∶27.31∶2.27∶1.88。

石花菜廣泛分布于中國(guó)沿海，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[27-28]，近年來(lái)隨著海洋藥物的發(fā)展，對(duì)石花菜多糖等海洋藻類多糖的研究也逐漸深入。為進(jìn)一步探索其生物學(xué)功能及作用機(jī)理，對(duì)石花菜多糖的詳細(xì)結(jié)構(gòu)分析，如單糖組成、糖苷鍵連接方式等的研究刻不容緩。本研究對(duì)石花菜多糖進(jìn)行了分離純化，對(duì)其理化性質(zhì)和單糖組成進(jìn)行了分析，可為石花菜多糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)解析及進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。