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芒針對骨關節(jié)炎大鼠炎癥反應及鎮(zhèn)痛作用影響的機制研究*

2020-04-30 01:08:32胡鳳軍姜迎萍
針灸臨床雜志 2020年3期
關鍵詞:芒針熱板軟骨

范 潔,胡鳳軍,王 波,姜迎萍△

(1.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊830001; 2.廣州市正骨醫(yī)院,廣東 廣州510045)

骨關節(jié)炎( Osteoarthritis,OA) 是一種多因素造成的關節(jié)軟骨退化、關節(jié)畸形等退行性病變[1-2]。近年來由于我國人口老齡化加重,OA 的發(fā)病率逐年升高[3]。研究表明OA 的發(fā)生與發(fā)展和機體炎癥反應密切相關,減少病變組織炎癥反應能顯著減輕關節(jié)的繼發(fā)性損傷并促進運動功能的恢復[4]。中醫(yī)中藥在OA的對癥治療中取得了長足的進展,龍膽苦苷、黃芪甲苷、南蛇藤素、黃連素、淫羊藿等越來越多的中藥單體成分被證明在抑制OA 的早期炎癥反應中發(fā)揮重要作用[5],另一方面,針灸治療OA 具有操作方便、療效顯著、無毒副作用等優(yōu)點,溫針、火針、電針等針灸療法均已普遍應用于OA 患者的臨床治療中[6-7],而芒針作為傳統(tǒng)針灸的一部分,其對OA 的治療效果及作用機制尚不明確。本實驗通過建立骨關節(jié)炎大鼠模型,探討芒針對OA 大鼠炎癥反應及鎮(zhèn)痛作用的影響,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

華佗牌0.25 mm×40 mm 針灸針( 蘇州醫(yī)療用品廠有限公司) ;泰盟PL-200 型熱刺痛儀( 成都泰盟科技有限公司) ; von Frey hair 纖毛機械刺激針( 北京中昊萬通科技有限公司) ;JL2B 型電脈沖刺激儀( 蘇州醫(yī)療用品廠有限公司) ; NO、SOD、MDA 檢測試劑盒( 自南京建成生物工程研究所) ; RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒( 碧云天) ; anti - IL -6、anti - TNF - α、anti-iNOS 抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG( CST) ;大鼠IL-6、TNF-α、iNOS ELISA 檢測試劑盒( 上海北諾生物) 。

1.2 實驗動物

30 只SD 大鼠購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心,體質量(200 ±20) g,分籠飼養(yǎng)于無特定病原體級實驗動物中心,實驗操作嚴格遵守動物倫理保護法等相關規(guī)定,所有大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后分組實驗。

1.3 實驗分組及造模

將大鼠隨機分為正常組、模型組和治療組,每組10 只。模型組和治療組大鼠給予5%水合氯醛腹腔麻醉后行仰臥位固定,配制100 mL 含1.6%木瓜蛋白酶溶液和0.3 mol/L 半胱氨酸溶液的混合液,向2 組大鼠雙后肢膝關節(jié)腔內注射混合液,每3 天造模注射1次,共注射3 次,正常組注射等量生理鹽水,同時根據(jù)超疲勞易致OA 發(fā)病的特點,每天強迫大鼠運動1 ~2 h。造模10 天后,隨機選取各組大鼠2 只頸椎脫臼處死,暴露膝關節(jié),取各組大鼠關節(jié)組織觀察造模是否成功,造模成功后給予治療組大鼠芒針針灸治療。

1.4 治療方法 模型組大鼠造模成功后不予治療,同時正常組大鼠不做任何處理。治療組大鼠采用自制固定器仰臥位固定于解剖板,彎曲大鼠雙膝呈45°固定。參照世界衛(wèi)生組織制定的國際標準穴位選取膝前、后三里二穴,針刺部位采用75%酒精常規(guī)消毒,取針刺入穴位4 ~5 mm深,捻轉1 min,將針灸針連接于JL2B型電脈沖刺激儀上,設置參數(shù)為2/100 Hz、1 mA,留針刺激15 min,左右隔次交替。每天治療1 次,5 天為1個療程,療程間隔休息2 天,共治療2 個療程。實驗完成后采用斷髓法處死全部大鼠,收集保存相應組織標本進行后續(xù)指標檢測。

1.5 大鼠行為學指標檢測

1.5.1 熱板致痛閾值檢測 最后1 個療程芒針治療結束后2 h,加熱熱板維持溫度在( 55 ±0.5) ℃,將各組大鼠分別置于熱板上,觀察從接觸熱板后1 min 內大鼠舔后足的反應時間,超過1 min 大鼠無明顯疼痛反應則取出大鼠終止實驗,記錄上述各組大鼠的疼痛反應時間為熱痛閾值( Paw withdraw ther-mal latency,PWTL) 。

1.5.2 機械性撤足閾值檢測 機械性撤足閾值檢測采用von Frey hair 方法[8],熱板致痛反應實驗結束后平靜大鼠恢復至正常狀態(tài),1 ~2 h 后將各組大鼠放置于箱底為金屬網(wǎng)板的丙烯酸籠內,適應15 ~30 min 后通過網(wǎng)孔采用von Frey hair 纖維絲分別向大鼠兩后足底部施加機械性刺激,持續(xù)4 ~6 s,觀察并記錄大鼠受到刺激后是否出現(xiàn)撤足或舔足反應,出現(xiàn)即記為陽性反應,產生陽性反應的最小纖維絲刺激力為大鼠雙側后肢撤足閾值( Paw withdrawal threshold,PWT) 。

1.6 血清NO、SOD、MDA 含量檢測

治療完成后采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠,固定大鼠并取腹主動脈血3 mL,室溫靜置2 h后4℃4 000 r/min 低速離心10 min,分離上層血清,分別采用硝酸還原酶法、羥胺法及硫代巴比妥酸( TBA) 法對血清內一氧化氮( NO) 、超氧化物歧化酶( SOD) 及丙二醛( MDA) 含量進行檢測,比較各組大鼠血清內NO、SOD、MDA 含量差異。

1.7 HE 染色觀察關節(jié)軟骨組織病理變化

取治療完成后各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織,采用4%多聚甲醛固定液4℃固定軟骨組織12 h 至過夜,12.5%EDTA 溶液脫鈣1 ~2 周,取出組織梯度酒精脫水,行常規(guī)石蠟包埋冠狀面10 mm 連續(xù)切片后經蘇木素伊紅( HE) 染色液染色后于光學顯微鏡下觀察各組大鼠關節(jié)軟骨組織病理變化情況,取清晰視野拍照保存。

1.8 大鼠軟骨組織相關炎性因子表達檢測

1.8.1 Western Blot 取實驗結束后各組大鼠軟骨組織40 ~60 mg 置于5 mL 管中,加入1 mL 含1%蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液充分勻漿研磨,冰浴裂解30 min。裂解完成后4℃12 000 r/min 離心收集蛋白上清,定量后加入1 × loading buffer 100℃變性蛋白5 min。取各組樣品等量蛋白行10%SDS -PAGE 凝膠電泳分離目的條帶并轉移至聚偏二氟乙烯膜上,5%BSA 封閉孵育1 h,4℃一抗孵育至過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫孵育1 h。將條帶轉移至凝膠成像儀,滴加發(fā)光液后曝光成像,拍照統(tǒng)計條帶上各組蛋白灰度值。

1.8.2 ELISA 取各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織,充分勻漿裂解15 min,4℃4 000 rpm 低速離心15 min 收集上清。參照雙抗夾心ELISA 試劑盒說明書,取等量樣品加入反應孔中于37℃水浴45 min,充分洗滌5 次,加入生物素標記的抗體37℃反應30 min,充分洗滌后再加入鏈霉親和素-過氧化物酶混勻37℃水浴30 min。加入顯色劑避光孵育15 min,終止顯色,上酶標儀檢測各反應孔于450 nm 波長處吸光值。

1.9 統(tǒng)計學分析

上述全部數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析,計量資料以 珋±s 表示,實驗重復3 次取均值,兩兩比較采用獨立樣本t 檢驗,組間差異采用單因素方差分析( ANOVA) ,P <0.05 認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 芒針對膝關節(jié)軟骨組織病理變化的影響

造模后可見模型組大鼠膝關節(jié)軟骨組織表面凹凸、增生嚴重,HE 染色顯示模型組大鼠軟骨細胞數(shù)量較正常組顯著減少,細胞形態(tài)畸變,出現(xiàn)過渡層細胞排列紊亂、組織間隙充血、腫脹、炎性細胞嚴重浸潤等病變現(xiàn)象,提示大鼠OA 模型造模成功。給予芒針治療后,治療組大鼠軟骨組織肉眼可見表面較為光滑平整,光鏡下顯示細胞排列有序,與模型組相比,少量可見細胞偏于一側,炎性細胞浸潤顯著減少,詳見圖1。

2.2 芒針對OA 大鼠的鎮(zhèn)痛作用

通過熱板致痛及von Frey hair 方法比較芒針治療對OA 大鼠鎮(zhèn)痛作用的影響,見表1,結果顯示相較于正常組,模型組大鼠熱板致痛反應敏感,PWTL 值顯著降低( P <0.05) ;治療2 療程后,芒針施治對大鼠熱板致痛反應有明顯鎮(zhèn)痛作用,大鼠痛閾值較模型組顯著增加( P <0.05) 。同時,比較3 組大鼠機械撤足閾值( PWT) 結果顯示,模型組與治療組大鼠PWT 值均較正常組顯著降低,但治療組PWT 值較模型組顯著增大,差異具有統(tǒng)計學意義( P <0.05) 。

2.3 各組大鼠血清NO、SOD、MDA 含量比較

檢測血清中NO、SOD、MDA 含量變化以驗證3 組大鼠抗自由基損傷作用能力,結果顯示,模型組較正常組大鼠血清內NO、MDA 含量顯著升高,而SOD 含量減少( P <0.05) ,給予芒針治療后,治療組大鼠體內NO、MDA 含量較模型組顯著降低,但與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義( P <0.05) ,SOD 含量較模型組顯著提升,且與正常組大鼠血清SOD 含量間差異無統(tǒng)計學意義( P >0.05) ,芒針促進大鼠體內抗自由基損傷作用增強,詳見表2。

圖1 HE 染色觀察3 組大鼠膝關節(jié)軟骨組織病理變化(400 ×)

圖2 芒針治療對3 組大鼠膝關節(jié)炎性因子表達影響

表1 芒針治療對3 組大鼠熱痛閾值、機械撤足閾值的影響 (珋±s)

表1 芒針治療對3 組大鼠熱痛閾值、機械撤足閾值的影響 (珋±s)

注:與正常組相比,aP <0.05;與模型組相比,bP <0.05。

組別 n PWTL( s) PWT( g)正常組10 42.61 ±3.17 27.39 ±1.32模型組 10 14.56 ±2.05a 10.75 ±0.96a治療組 10 29.15 ±4.11ab 18.03 ±2.21 ab

表2 芒針治療對3 組大鼠血清內NO、SOD、MDA 含量的影響 (珋±s)

表2 芒針治療對3 組大鼠血清內NO、SOD、MDA 含量的影響 (珋±s)

注:與正常組相比,aP <0.05;與模型組相比,bP <0.05。

組別 n NO[c/( mmol·kg) ]SOD[ρ/( U·mL) ]MDA[c/( nmol·L) ]正常組10 2.51 ±0.41 161.10 ±11.37 2.06 ±0.70模型組 10 17.38 ±1.78a 129.58 ±14.01a 10.71 ±1.69a治療組 10 8.38 ±1.19ab 147.62 ±6.88a 6.33 ±1.20 ab

2.4 各組大鼠膝關節(jié)炎性因子表達變化

Western Blot 和ELISA 用于檢測各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織中炎性介質表達變化,如圖2A,WB 結果顯示模型組大鼠組織內TNF -α、IL -6 以及iNOS 蛋白表達較正常組大鼠顯著增加( P <0.05) ,而與模型組相比,治療組大鼠上述蛋白表達均有減少。ELISA 結果顯示芒針治療后,治療組大鼠TNF -α、IL -6、iNOS表達較模型組顯著降低,與WB 結果一致,各組炎性因子表達見圖2B,差異具有統(tǒng)計學意義( P <0.05) 。

3 討論

中醫(yī)治療一直是國內臨床醫(yī)治OA 的重要手段[9-10],從中醫(yī)理論出發(fā),OA 被歸結為“痹證”范疇,血虛風擾、濕郁化熱、風寒濕相搏等均有可能成為OA潛在的致病機制,與此同時,根據(jù)郭躍等[11]對OA 的辨證論治,將OA 患者證候分為氣滯血瘀型、肝脾腎陽虛型、肝腎虧虛型3 類,并根據(jù)不同證候的患者提供了不同的治療方法和手段。芒針發(fā)源于古代九針之一的“長針”,具有取穴少、透穴多、針感強、傳導快等諸多特點[12],已被報道在神經系統(tǒng)疾病、胃腸道疾病及婦科疾病中發(fā)揮重要作用[13-14],近期研究表明,芒針可以通過改善脊髓損傷后的炎癥反應和細胞凋亡促進脊髓功能修復和后肢運動能力的提升[15],而關于芒針對OA 患者的治療機制未見報道,故展開本研究。

伴隨OA 的發(fā)生發(fā)展,膝關節(jié)軟骨組織及周圍骨質代償性增生、關節(jié)滑膜組織的炎癥浸潤是加劇軟骨穩(wěn)態(tài)破壞和膝骨損傷的重要因素,因此維持膝關節(jié)骨細胞正常代謝和關節(jié)組織形態(tài)是治療過程中的重要考量因素,HE 染色結果顯示,芒針給予OA 大鼠治療2個療程后,治療組大鼠膝關節(jié)軟骨組織病變較模型組顯著改善,過渡層細胞形態(tài)規(guī)則,炎性細胞浸潤減少,提示芒針可能通過促進膝關節(jié)組織損傷修復,減輕炎癥反應,治療并改善OA 病癥。行為學實驗表明,芒針促進OA 大鼠鎮(zhèn)痛作用增強,治療組大鼠PWTL 值及PWT 值均較模型組顯著升高( P <0.05) ,同時PWT 是反應神經根疼痛的常用指標,PWT 的大小與神經根疼痛程度呈顯著負相關[16],本實驗結果表明芒針可能通過緩解神經根疼痛提高OA 大鼠PWT 值,促進OA 大鼠鎮(zhèn)痛作用增強。另一方面,既往研究表明,體液內高水平的氧自由基是造成骨關節(jié)損傷、炎癥反應爆發(fā)的重要因素[17],NO 作為一種重要的炎癥介質,其在血液中的含量與動物體內炎癥反應顯著相關,NO 的積聚更會誘發(fā)嚴重的關節(jié)損傷[18]; 與此同時,動物體內的自由基與脂質體發(fā)生過氧化反應產生的MDA 會對動物體自身產生細胞毒作用,MDA、NO 的超負荷均會對大鼠的炎癥反應及生存狀態(tài)產生重要影響。本研究結果顯示,模型組大鼠體內NO、MDA 含量較正常組顯著升高,反之SOD 含量顯著減少,由此說明OA 大鼠體內抗自由基損傷作用嚴重減弱,芒針治療后,治療組大鼠體內NO、MDA 及SOD 含量變化提示,芒針施治OA大鼠膝前、后三里等穴位能夠顯著抑制大鼠體內NO、MDA 的產生及積聚,同時促進SOD 含量升高,最終起到清除體內自由基、抑制炎癥反應發(fā)生的作用。由此,進一步檢測OA 大鼠體內iNOS 蛋白的表達,我們發(fā)現(xiàn)治療組大鼠iNOS 表達較模型組顯著降低,iNOS 作為機體NOS 活性氮自由基產生的重要催化酶,iNOS 表達的降低進一步解釋了芒針抑制NO 的合成機制。同時,IL-6、TNF-α 已被報道參與OA 相關的NF-κB、MAPKs 等信號通路調控[19],參與誘導無菌性炎癥爆發(fā),WB 和ELISA 結果進一步證明了芒針能夠顯著抑制OA 大鼠膝關節(jié)軟骨組織IL-6、TNF-α的表達,起到促進免疫調節(jié)、抑制炎癥反應的作用。

綜上所述,本研究根據(jù)近部取穴、循經取穴的原則,給予OA 大鼠芒針施治膝前、后三里二穴,益氣補血、消炎化瘀,發(fā)揮對膝關節(jié)軟骨組織的局部治療作用,療效確切。選穴配穴參照以往的研究報道[20-21],一方面針刺膝前穴位是對深膝肌群的肌力訓練及恢復,能夠平衡在OA 的發(fā)生發(fā)展過程中軟骨細胞、細胞外基質及軟骨下骨三者偶聯(lián)產生的力學平衡失衡現(xiàn)象。另一方面,中醫(yī)學認為“針必取三里,灸必加關元”,針刺后三里具有疏經通絡、強壯身體的作用,臨床已將足三里配伍其穴學位,通過電針、水針、激光針灸等用于多種鎮(zhèn)痛及經絡調理的治療中。本研究首次選用足三里配伍膝前穴位,采用芒針針灸的方法對骨關節(jié)炎大鼠的炎癥反應及鎮(zhèn)痛作用和機制進行了探究,結果表明該針灸療法可能與降低軟骨組織IL -6、TNF-α、iNOS 的表達、促進大鼠體內抗自由基損傷作用有關,通過抑制炎癥反應,發(fā)揮OA 大鼠抗炎鎮(zhèn)痛、改善膝骨關節(jié)功能、緩解骨關節(jié)炎病證的作用。

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