鄧德雷，羅超越，邱慧珍，張 健，張春紅，付 笑，沈其榮

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省畜禽廢棄物資源化利用工程研究中心，甘肅 蘭州 730070；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210095)

根際是土壤和根之間的界面，是土壤的生物活性區(qū)域[1]。農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中根際微生物群落的多樣性受植物類型、土壤類型、農(nóng)田管理和其它環(huán)境因素的影響[2]。農(nóng)田管理如長(zhǎng)期連作和施肥等栽培措施，特別是過(guò)量施氮肥已成為限制甘肅省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)定西市馬鈴薯產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要限制因素[3]。在馬鈴薯種植過(guò)程中為了片面追求高產(chǎn)，過(guò)量施氮和長(zhǎng)期連作現(xiàn)象十分普遍[4-5]。過(guò)量施氮和長(zhǎng)期連作都會(huì)導(dǎo)致土壤微生物區(qū)系從“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)化，最終引發(fā)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與組成失衡，導(dǎo)致土壤微生物區(qū)系失衡[3,6]。定西市集約化種植馬鈴薯過(guò)程中的施氮用量平均為230 kg·hm-2，而馬鈴薯生產(chǎn)中每形成1 t塊莖產(chǎn)量，僅需純氮6.5±1.77 kg[3]。土壤中氮?dú)埩袅炕驌p失量顯著增加，長(zhǎng)期連續(xù)施用氮肥，將會(huì)導(dǎo)致農(nóng)田土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)遭受破壞[7-8]，群落組成發(fā)生改變[9]。

對(duì)于馬鈴薯來(lái)講，過(guò)量施氮和連作均能夠引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著變化，使得土壤從抑病型向?qū)Р⌒偷姆较蜣D(zhuǎn)變，土傳病害滋生，作物長(zhǎng)勢(shì)變差并且大幅度降低農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量，而這其中大部分是真菌型的土傳病害[3,10]。因此，了解土壤真菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的理論和實(shí)踐意義。許多研究證明，土壤類型是影響細(xì)菌的最主要因素[10-11]，而農(nóng)田管理是影響真菌的最主要因素[12-13]。

目前，有關(guān)不同施氮量對(duì)微生物群落的影響多側(cè)重于細(xì)菌，而對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響研究較少。過(guò)量施氮和長(zhǎng)期連作都是不健康的農(nóng)田管理，這將會(huì)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)發(fā)育受阻，塊莖產(chǎn)量和品質(zhì)下降，特別是土傳病害猖獗等一系列的問(wèn)題，嚴(yán)重影響企業(yè)和農(nóng)民的種植效益。本課題組前期對(duì)馬鈴薯連作與土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)之間的相互作用做了大量研究，孟品品等[5]研究了馬鈴薯連作對(duì)根際土壤真菌種群結(jié)構(gòu)的影響及其生物效應(yīng)，結(jié)果表明，隨著連作年限的增加，馬鈴薯根際土壤土傳病害病原菌尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌的數(shù)量明顯增加。牛秀群等[14]研究了馬鈴薯連作根際土壤鐮刀菌分布與馬鈴薯連作之間的關(guān)系，結(jié)果顯示連作1～3 a的優(yōu)勢(shì)種均為茄病鐮孢。李瑞琴等[15]通過(guò)熒光定量PCR快速檢測(cè)及在根際的動(dòng)態(tài)變化的研究，結(jié)果顯示連作1～5 a的馬鈴薯根際土壤茄病鐮孢菌和接骨木鐮孢菌隨連作年限的遞增呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中連作5 a的累積量達(dá)到最大。

作物增產(chǎn)的農(nóng)業(yè)措施之一是施用氮肥，而目前在我國(guó)糧食生產(chǎn)中存在氮肥用量不足和過(guò)量的問(wèn)題，這兩方面都將會(huì)嚴(yán)重阻礙農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展進(jìn)程[3]。因此，了解氮肥施用量對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的理論和實(shí)踐意義。針對(duì)當(dāng)?shù)匾蜷L(zhǎng)期過(guò)量施氮而導(dǎo)致的諸如立枯病、干腐病和黃萎病等真菌類土傳病害嚴(yán)重的現(xiàn)象，將真菌群落結(jié)構(gòu)作為我們研究的重點(diǎn)。因此，本研究利用Illumina PE250基因測(cè)序，比較連續(xù)不同施氮條件下的馬鈴薯根際真菌群落結(jié)構(gòu)差異，旨在探明和揭示過(guò)量氮素施用對(duì)半干旱地區(qū)馬鈴薯根際真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為該地區(qū)馬鈴薯生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

田間定位試驗(yàn)始于2013年4月，試驗(yàn)地位于甘肅省定西市安定區(qū)香泉鎮(zhèn)，當(dāng)?shù)氐乩砦恢?5°27′7″N，104°30′34″E，海拔2 053～2 556 m。試驗(yàn)地所在區(qū)域年均溫度6.9℃，≥10℃的積溫為2 075.1℃，年降雨量400 mm左右，多集中在7—9月，無(wú)霜期140 d，蒸發(fā)量1 400 mm以上,屬中溫帶半干旱氣候，土壤類型為黃綿土。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究共設(shè)置6個(gè)不同的氮用量：N0(對(duì)照，不施氮肥)、N75(施氮量為75 kg·hm-2)、N150(150 kg·hm-2)、N225(225 kg·hm-2)、N300(300 kg·hm-2)、N375(375 kg·hm-2)。本研究是以當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施氮量225 kg·hm-2為依據(jù)，不施氮肥為對(duì)照處理，每一處理4次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積為9 m×7.2 m =64.8 m2。每個(gè)處理配施等量的磷鉀肥，施磷量為P2O5225 kg·hm-2，施鉀量為K2O 292.5 kg·hm-2。N肥為尿素(N,46%)，配施磷肥為過(guò)磷酸鈣(P2O5, 16%),鉀肥為硫酸鉀鎂(K2O, 24%)。肥料按小區(qū)稱重撒施后旋耕，旋耕后起壟。壟寬60 cm，壟距60 cm，壟高20 cm，起壟后覆膜。人工點(diǎn)播的方法播種，寬壟雙行，深10 cm，株距25 cm，種植密度為4 450株·667m-2。馬鈴薯品種是“青薯九號(hào)”原種。于2017年5月12日播種，10月20日收獲。

1.3 土壤樣品采集與處理

根際樣品在馬鈴薯成熟期進(jìn)行采集，采集時(shí)間為2017年10月18日。根際土的采集方法：將馬鈴薯的根完整挖出，先用抖土法抖落掉多余的土后(將附著在根表面不能被抖下來(lái)的土視為根際土)，裝于滅菌后的自封袋內(nèi)，并于當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室用滅菌蒸餾水沖洗(三角瓶?jī)?nèi)加40～50 ml蒸餾水，在搖床上以200 r·min-1的轉(zhuǎn)速震蕩5～10 min)，過(guò)濾后用真空泵抽取多余的水分，隨后在真空冷凍干燥機(jī)上凍干，并裝于5 ml的無(wú)菌管中，放置于-80℃冰箱，用于土壤微生物DNA的提取。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

土壤理化性質(zhì)的測(cè)定參照《土壤農(nóng)化分析》[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。速效磷的測(cè)定采用鉬銻抗比色法；有機(jī)質(zhì)的測(cè)定采用重鉻酸鉀氧化外加熱法測(cè)定；土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的測(cè)定：以0.01 mol·L-1的CaCl2溶液浸提，震蕩1 h,后用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定；土壤pH值測(cè)定采用電極法測(cè)定。

1.5 土壤DNA提取及PCR擴(kuò)增

DNA提取：采用E.Z.N.A. Soil DNAKit(OMEGA)試劑盒進(jìn)行土壤總DNA的提取，每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行PCR擴(kuò)增。在測(cè)序前參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組進(jìn)行DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)應(yīng)加入的DNA量。PCR所用引物序列為ITS1-F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和ITS2:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′ ，PCR所用引物為Miseq測(cè)序平臺(tái)的通用引物。熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)體系如下: 5 × FastPfu Buffer 4 μl，2.5 mM dNTPs 2 μl，F(xiàn)orward Primer(5 μM) 0.8 μl，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μl，Template DNA 10 ng，加去離子水至20 μl。反應(yīng)條件如下:95℃ 5 min預(yù)變性，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 10 min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°延伸7 min。PCR結(jié)束后，全部樣本按照正式實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase。PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型

1.6 數(shù)據(jù)處理

土壤的基本理化性質(zhì)數(shù)據(jù)處理及圖表繪制采用Excel 2013和Origin 2017軟件，SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。同時(shí)運(yùn)用R 3.3.1等相關(guān)軟件計(jì)算土壤真菌群落Alpha多樣性指數(shù)如Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等，同時(shí)進(jìn)行根際真菌群落的Beta多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 連續(xù)施用不同氮量對(duì)馬鈴薯根際真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

Illumina PE250測(cè)序結(jié)果優(yōu)化后共獲得297623條有效序列，通過(guò)OTU(Operational taxonomic units)聚類分析得到3459個(gè)OTU；同時(shí)檢測(cè)出根際真菌主要分布在7個(gè)門(mén)，22個(gè)綱，64個(gè)目，158個(gè)科，333個(gè)屬，676個(gè)種中。在97%相似水平條件下得到土壤真菌多樣性指數(shù)如表1所示。由表1可知各處理樣本文庫(kù)覆蓋率均大于99.7%，說(shuō)明本試驗(yàn)樣品取樣合理，置信度高、結(jié)果可靠，測(cè)定結(jié)果能夠真實(shí)地反映各處理根際樣本的真菌群落組成。通過(guò)對(duì)根際樣品中真菌群落的相對(duì)豐度指數(shù)(Chao 1)分析發(fā)現(xiàn)，N150處理Chao 1指數(shù)為758.25，顯著高于其它施氮處理，過(guò)量施氮降低真菌豐富度，N150處理相比N0、N75、N225、N300和N375高36.56%、19.83%、16.79%、1.34%、16.25%。同時(shí)通過(guò)對(duì)根際樣品中真菌群落的多樣性(Shannon和Simpson)進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明，不同施氮量對(duì)土壤真菌群落的多樣性影響無(wú)顯著差異。

為進(jìn)一步分析不同施氮量對(duì)根際真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，首先從門(mén)水平對(duì)真菌群落進(jìn)行分析。根際樣品共檢測(cè)出3個(gè)優(yōu)勢(shì)門(mén)類真菌(相對(duì)豐度>1.0%)，主要由子囊菌門(mén)(Ascomycota)、Mucoromycota和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)組成，如圖1所示。

表1 連續(xù)施用不同氮量對(duì)根際真菌群落相對(duì)豐度與多樣性的影響

注：不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同

Note: Different letters indicate significant difference among treatments (P<0.05). The same below.

圖1 連續(xù)施用不同氮量根際土壤真菌優(yōu)勢(shì)門(mén)群落組成Fig.1 Continuous application of different N content in rhizosphere soil fungi phylum community composition

分析結(jié)果顯示，不同施氮量對(duì)根際真菌群落物種組成造成了顯著影響。其中子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度最大，占總序列的75.48%～83.95%；N150和N225處理的子囊菌門(mén)相對(duì)豐度分別為83.95%和83.24%，顯著高于其它處理。同時(shí)，子囊菌門(mén)相對(duì)豐度的變化趨勢(shì)可以分為低氮量(N0和N75處理)、中氮量(N150和N225處理)和高氮量(N300和N375處理)，中氮量子囊菌門(mén)相對(duì)豐度分別比低氮和高氮多8.04%和9.54%。這說(shuō)明適量的氮肥用量可以增加子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度，但過(guò)量施氮反而會(huì)使其受到抑制。各處理的擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度分別為2.10%、6.31%、4.19%、4.23%、5.03%和4.31%，N75處理的擔(dān)子菌相對(duì)豐度顯著高于其它處理，施氮量超過(guò)75 kg·hm-2時(shí)擔(dān)子菌的相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)。各處理Mucoromycota相對(duì)豐度分別為5.62%、5.62%、6.45%、6.09%、8.09%和7.15%，隨施氮量的增加呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)。雖然隨施氮量的增加促進(jìn)了馬鈴薯根際子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)的豐度，但過(guò)量施氮會(huì)抑制子囊菌和擔(dān)子菌的生長(zhǎng)。

如圖2所示，土壤中真菌綱水平的優(yōu)勢(shì)物綱(相對(duì)豐度>1.0%)主要有糞殼菌綱(Sordariomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、銀耳菌綱(Tremellomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、Accomycota-norank和Mucoromycota-norank共7個(gè)優(yōu)勢(shì)綱。研究結(jié)果顯示糞殼菌綱是子囊菌門(mén)的第一大優(yōu)勢(shì)類群，其相對(duì)豐度為47.36%～64.12%，在真菌綱中處于最優(yōu)勢(shì)菌綱，隨施氮量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，N150處理相對(duì)豐度達(dá)到最大。座囊菌綱的變化趨勢(shì)與糞殼菌綱一致，相對(duì)豐度為7.16%～11.36%，N150處理相對(duì)豐度達(dá)到最大。銀耳菌綱相對(duì)豐度可以占到所有真菌綱的3.18%～10.63%，N300處理相對(duì)豐度均達(dá)到最大，結(jié)果顯示施氮可以增加銀耳菌綱的相對(duì)豐度，過(guò)量施氮?jiǎng)t會(huì)受到抑制。錘舌菌綱的相對(duì)豐度為0.89%～2.37%，N0處理高于其它處理，與N0相比各施氮處理分別降低了47.79%、62.56%、29.72%、51.46%和61.81%，說(shuō)明隨著施氮量的增加錘舌菌綱相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)。

圖2 不同施氮量處理綱水平下土壤真菌優(yōu)勢(shì)群落組成Fig.2 Composition of class community of soil fungi under different levels of N application

進(jìn)一步從根際真菌屬的角度分析不同施氮量對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如表2所示。供試土壤樣品共檢測(cè)出13個(gè)優(yōu)勢(shì)屬(相對(duì)豐度>1.0%)。其中Plectosphaerella、鐮刀菌屬(Fusarium)、梭孢殼屬(Thielavia)、短梗蠕孢屬(Trichocladium)、枝孢屬(Cladosporium)、Paramyrothecium、四枝孢菌屬(Tetracladium)、鏈格孢屬(Alternaria)、毛殼菌屬(Chaetomium)、Lectera、枝頂孢屬(Acremonium)屬于子囊菌門(mén)；被孢霉屬(Mortierella)屬于Mucoromycota門(mén)；Vishniacozyma屬于擔(dān)子菌門(mén)。

由表2可知，過(guò)量施氮顯著增加Fusarium(鐮刀菌屬)的相對(duì)豐度，且N375處理達(dá)到最大，其相對(duì)豐度為13.54%，顯著高于N75處理的相對(duì)豐度(8.38%)，N0處理的相對(duì)豐度為9.63%。且N375和N0處理的鐮刀菌屬豐度相比N75處理多 61.58%及14.91%，結(jié)果表明低氮量和高氮量增加了鐮刀菌屬的豐度。Alternaria(鏈格孢屬)各處理的相對(duì)豐度分別為1.89%、1.39%、1.17%、0.70%、1.07%和1.80%，N225處理的豐度最低，N0和N375處理的鏈格孢屬相對(duì)豐度別是N225處理的2.70、2.57倍。據(jù)報(bào)道，鐮刀菌屬和鏈格孢屬是引起植物破懷性病害的主要病原真菌[17-18]，以上結(jié)果說(shuō)明過(guò)低或過(guò)高的施用氮肥會(huì)加劇鐮刀屬和鏈格孢屬的相對(duì)豐度，病原菌的增加對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)不利，影響馬鈴薯的產(chǎn)量，造成經(jīng)濟(jì)收益下降。隨施氮量的增加能產(chǎn)生脂肪酸等有機(jī)化合物的被孢霉屬(Mortierella)也明顯增加，其相對(duì)豐度分別為5.59%、4.81%、5.79%、8.55%、9.71%和8.24%，且N75、N150、N225、N300以及N375處理比N0處理增加了-13.95%、3.58%、52.95%、73.70%及47.41%。由于被孢霉屬可以產(chǎn)生有機(jī)酸，結(jié)果可能導(dǎo)致根際土壤酸化。

2.2 連續(xù)施用不同氮量對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

連續(xù)施用不同氮量對(duì)馬鈴薯土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生了顯著影響，在大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)中，我們選取了硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、pH值、有效磷和有機(jī)質(zhì)以展開(kāi)進(jìn)一步的分析，詳細(xì)結(jié)果如表3所示。分析結(jié)果顯示，隨著施氮量的增加土壤中NO-3-N含量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，在N375處理NO-3-N含量達(dá)到最大，為21.90 mg·kg-1，并且顯著高于其它處理，N75、N150、N225、N300和N375處理分別是N0處理的1.24、1.70、1.94、2.98倍和3.76倍。隨著施氮量的增加土壤中NH+4-N含量與NO-3-N含量變化趨勢(shì)一致。結(jié)果說(shuō)明連續(xù)施用氮肥顯著提高了土壤中的礦質(zhì)氮含量。由表3可知，隨著施氮量的增加土壤pH值呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，各施氮處理分別比N0降低了0.06、0.07、0.08、0.15和0.17個(gè)單位。土壤pH值結(jié)果說(shuō)明，長(zhǎng)期大量的連續(xù)使用氮肥，已導(dǎo)致土壤pH值下降。因此，在農(nóng)田管理過(guò)程中不宜大量的施用氮肥。

由表3數(shù)據(jù)可以看出，施氮量對(duì)表層速效磷含量的變化有顯著影響。隨施氮量增加速效磷含量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，N0處理速效磷含量顯著高于其他處理，與N0相比其它施氮處理分別降低了7.34%、18.31%、26.19%、29.68%和32.10%?？赡艿脑蚴请S著施氮量的增加提高了馬鈴薯的生長(zhǎng)發(fā)育以及其對(duì)磷素的需求，從土壤中吸收磷素也就更多，顯著降低了速效磷含量。連續(xù)5 a施用不同氮量的研究發(fā)現(xiàn)，與N0相比，本研究中隨著施氮量的增加土壤的有機(jī)質(zhì)的含量稍有提高，然而不同的施氮處理對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)的影響差異不顯著。

表2 連續(xù)施用不同氮量處理屬水平下根際真菌優(yōu)勢(shì)群落組成及相對(duì)豐度

表3 連續(xù)施用不同氮量對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

2.3 真菌群落與土壤理化性質(zhì)的冗余分析(RDA)

為進(jìn)一步了解環(huán)境因素對(duì)根際真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，將真菌群落的變化與環(huán)境因子如有機(jī)質(zhì)(SOM)、pH值、速效磷(AP)、硝態(tài)氮(NO-3-N)和銨態(tài)氮(NH+4-N)之間進(jìn)行了冗余分析(RDA)，結(jié)果如圖3所示。真菌群落結(jié)構(gòu)差異在兩個(gè)排序軸上的解釋率分別為8.10%、5.22%，NO-3-N和NH+4-N呈正相關(guān)，而pH值和AP呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，同時(shí)從圖中可以看出，NO-3-N指向了N150、N225、N300和N375四個(gè)處理的真菌群落。判斷排序的結(jié)果可以接受環(huán)境因子對(duì)物種分布的解釋量的結(jié)果顯示，NO-3-N是影響根際真菌群落變化的主要因子(F=1.571，P=0.043*)。

注：SOM，AP，NO-3-N，NH+4-N分別代表土壤有機(jī)質(zhì)，速效磷，硝態(tài)氮含量，銨態(tài)氮含量；P值通過(guò)999次置換檢驗(yàn)得出，顯著性標(biāo)記為*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.Note:SOM, AP, NO3-N, and NH+4-N represent soil organic matter, available phosphorus, nitrate N content, ammonium N content; P value was obtained by 999 replacement tests. * P < 0.05 ; ** P < 0.01; *** P < 0.001.圖3 土壤真菌與環(huán)境因子之間的RDA分析Fig.3 RDA analysis between soil fungi and environmental factors

2.4 真菌群落結(jié)構(gòu)的變化與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步確定影響真菌的優(yōu)勢(shì)菌群的環(huán)境因子，將部分土壤理化性質(zhì)與根際真菌群落結(jié)構(gòu)的分布進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表4、表5和表6。分析結(jié)果顯示真菌群落結(jié)構(gòu)在門(mén)水平、綱水平和屬水平上與NO-3-N含量具有顯著相關(guān)性，與AP呈顯著正相關(guān)的真菌優(yōu)勢(shì)菌群為鏈格孢屬(Alternaria)，與pH和AP呈顯著負(fù)相關(guān)同時(shí)與NO-3-N含量呈顯著正相關(guān)的真菌優(yōu)勢(shì)菌群有Mucoromycota_norank和被孢霉屬(Mortierella)。而糞殼菌綱(Sordariomycetes)和鐮刀菌屬(Fusarium)僅與AP含量顯著負(fù)相關(guān)。

2.5 連續(xù)施用不同氮量處理對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量的影響

氮素是馬鈴薯產(chǎn)量形成的關(guān)鍵限制因子，通過(guò)實(shí)際測(cè)產(chǎn)，馬鈴薯塊莖產(chǎn)量結(jié)果如圖4所示。分析結(jié)果顯示，N75處理馬鈴薯產(chǎn)量最高，為26 410 kg·hm-2,與N75相比，N0、N150、N225、N300、N375的塊莖產(chǎn)量分別降低了7.58%、3.46%、22.81%、26.05%和25.32%。結(jié)果說(shuō)明，隨施氮量的增加馬鈴薯塊莖產(chǎn)量并不會(huì)隨之升高，過(guò)量的施用氮肥反而會(huì)導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量下降，造成嚴(yán)重的氮肥資源浪費(fèi)。

通過(guò)對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量與土壤的NO-3-N、NH+4-N、pH、有機(jī)質(zhì)和速效磷的相關(guān)性分析，結(jié)果如表7所示。結(jié)果顯示，馬鈴薯產(chǎn)量與NO-3-N呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01，r=-0.578)，與NH+4-N含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05，r=-0.437)，與土壤pH值呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01，r=0.556)，與有機(jī)質(zhì)和速效磷則沒(méi)有顯著的相關(guān)性。這說(shuō)明NO-3-N和NH+4-N含量的增加以及pH值下降導(dǎo)致了馬鈴薯產(chǎn)量降低。

表4 真菌優(yōu)勢(shì)菌群與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性分析(門(mén)水平)

注 Note： *P<0.05;**P<0.01.下同 The same below.

表5 真菌優(yōu)勢(shì)菌群與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性分析(綱水平)

表6 真菌優(yōu)勢(shì)菌群與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性分析(屬水平)

3 討 論

3.1 連續(xù)施用不同氮量對(duì)土壤理化性質(zhì)和馬鈴薯產(chǎn)量的影響

本研究結(jié)果顯示，隨著施氮量的增加顯著降低了土壤pH值，這主要是因?yàn)槟蛩厥┤胪寥篮?，在脲酶作用下先將酰胺態(tài)氮水解生成NH+4，然后在硝化作用下將NH+4轉(zhuǎn)化成NO-3，而硝化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的H+，使土壤pH值下降[19]。有研究表明，隨著施氮量的增加，淺層土壤的硝態(tài)氮含量顯著增加，當(dāng)施氮量高于207 kg·hm-2時(shí)，隨著施氮量增加土壤NO-3-N的積累量顯著增加[20]，這與本研究結(jié)果基本一致，其原因是在硝化作用下氨態(tài)氮向硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化，使土壤中硝態(tài)氮含量大量富集。Wang Qi等[21]的研究表明，在有限的灌溉條件下，當(dāng)施氮量為221 kg·hm-2時(shí)表層土壤NO-3-N積累量增加，當(dāng)施氮量增加至300 kg·hm-2時(shí)，0～200 cm土層中土壤NO-3-N積累量顯著增加。

我國(guó)在有限的土壤上投入大量的化肥，與迅速增長(zhǎng)的化肥施用量相比，作物產(chǎn)量并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的結(jié)果[22]。本研究中，N0處理的馬鈴薯產(chǎn)量為24 408 kg·hm-2，然而，當(dāng)施氮量為75 kg·hm-2時(shí)，產(chǎn)量為26 410 kg·hm-2，僅提高了8.20%。與N75相比，N150、N225、N300和N375產(chǎn)量分別降低了3.46%、22.81%、26.05%和25.32%，隨著施氮量的增加，馬鈴薯的產(chǎn)量并沒(méi)有持續(xù)增加。對(duì)于馬鈴薯來(lái)講，過(guò)量施氮和連作均能夠引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著變化，使得土壤從抑病型向?qū)Р⌒偷姆较蜣D(zhuǎn)變，土傳病害滋生，作物長(zhǎng)勢(shì)變差并且大幅度降低農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量[23]。因此，本研究結(jié)果表明，連續(xù)大量施氮不利于馬鈴薯高產(chǎn)。

圖4 連續(xù)施用不同氮量對(duì)馬鈴薯塊莖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of continuous application of different nitrogen rates on potato tuber yield

表7 Spearman相關(guān)性分析

3.2 連續(xù)施用不同氮量對(duì)馬鈴薯根際真菌Alpha多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

本研究結(jié)果顯示，過(guò)量施氮會(huì)降低馬鈴薯根際真菌群落多樣性，這與Biotechnology[24]和Vandenkoornhuyse[25]等的研究結(jié)果基本一致。但也有研究[26]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期施用氮肥會(huì)增加真菌群落的多樣性，究其原因可能是因?yàn)樵谕寥罓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增加時(shí)，豐富類群能利用有效碳源快速生長(zhǎng)，因此可以在較高氮含量的環(huán)境下較好地生長(zhǎng)繁殖，而貧瘠類群在環(huán)境中生長(zhǎng)速度較低，吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力較弱，因此在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較高時(shí)，這些貧瘠類群與豐富類群相比競(jìng)爭(zhēng)力較弱，不能良好生長(zhǎng)繁殖[27]，導(dǎo)致其數(shù)量下降。

馬鈴薯根際真菌群落結(jié)構(gòu)主要由子囊菌門(mén)、Mucoromycota和擔(dān)子菌門(mén)構(gòu)成，這與季凌飛等[28]、陳丹梅等[29]、Hedlund K等[30]在茶園土壤、植煙土壤和南方典型水稻土壤的研究結(jié)果相一致。有研究發(fā)現(xiàn)，子囊菌門(mén)的生長(zhǎng)與氮素的含量有關(guān)[31]。Wang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)高的氮素對(duì)子囊菌門(mén)的生長(zhǎng)有害。長(zhǎng)期大量施氮可能會(huì)促使根際真菌群落多樣性降低，群落結(jié)構(gòu)主要朝子囊菌，Mucoromycota和擔(dān)子菌三個(gè)方向演替。本研究發(fā)現(xiàn)，適量施氮(N150和N225)條件下子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度為83.95%和83.24%，顯著高于其他處理，說(shuō)明適量的施用氮肥可以增加子囊菌門(mén)的豐度，但當(dāng)施氮量過(guò)低或過(guò)高時(shí)不利于子囊菌的生長(zhǎng)。Paungfoo-Lonhienne等[33]在甘蔗根際和土壤中研究結(jié)果顯示，與低氮處理相比，高氮肥條件下真菌群落子囊菌的相對(duì)豐度通常較高，而擔(dān)子菌較低，增加氮肥會(huì)改變真菌群落的組成，并且通過(guò)促進(jìn)病原真菌，可能對(duì)植物健康產(chǎn)生負(fù)面的影響。

本研究中子囊菌門(mén)的群落構(gòu)成與Sun等[26]在不同施肥模式的旱地土壤中的結(jié)果相一致，子囊菌門(mén)的優(yōu)勢(shì)種群是糞殼菌綱(Sordariomycetes)。Sordariomycetes綱是馬鈴薯根際真菌的優(yōu)勢(shì)物種，表明連續(xù)施用不同氮量可能會(huì)導(dǎo)致根際真菌群落組成的差異。Sordariomycetes綱的相對(duì)豐度為47.36%～64.12%，該類群中的肉座菌目(Hypocreales)、Hypocreales和散囊菌目(Eurotiales)和散囊菌綱(Eurotiomycetes)等多數(shù)物種有研究被證實(shí)具有產(chǎn)生N2O的能力[34]。眾所周知，N2O是一種潛在的溫室氣體，而且還能夠破壞大氣中的臭氧層[35]。因此增加施氮量將會(huì)促進(jìn)Sordariomycetes真菌微生物的繁殖，進(jìn)一步促進(jìn)N2O的產(chǎn)生。N0處理土壤中錘舌菌綱(Leotiomycetes)數(shù)量最高且顯著高于其它施氮處理，與N0相比N75～N375處理分別降低了47.79%、62.56%、29.72%、51.46%和61.81%。不同氮肥處理的錘舌菌綱類群中75.33%～86.08%的類群屬于柔膜菌目(Helotiales)，此類群真菌多數(shù)是根際真菌，能夠?yàn)樗拗髦参锾峁B(yǎng)分，幫助其固定有機(jī)物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[36]，本研究結(jié)果顯示，該類真菌的數(shù)目隨施氮量的增加而降低。Dean等[37]也曾報(bào)道過(guò)類似的結(jié)果，它們豐度的降低預(yù)示著高氮環(huán)境中真菌與作物的共生關(guān)系將會(huì)減弱。

在優(yōu)勢(shì)屬水平細(xì)菌的分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期連續(xù)施用氮肥過(guò)程中低氮量和高氮量顯著增加了Fusarium(鐮刀菌屬)的豐度，N375處理和N0處理的鐮刀菌屬豐度相比N75處理多61.58%及14.91%。這個(gè)結(jié)果與孟品品等[5]、牛秀群等[14]的研究結(jié)論相符。孟品品等[5]研究表明隨著連作年限的增加，馬鈴薯收獲期根際土壤土傳病害病原菌尖孢鐮刀菌和茄病鐮孢菌的數(shù)量明顯增加。牛秀群等[14]研究認(rèn)為在1～3 a連作中，隨著連作年限的增加，馬鈴薯根茬中分離的鐮刀菌數(shù)量呈上升趨勢(shì)。據(jù)資料顯示，馬鈴薯連作導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)顯著改變，病原菌成為優(yōu)勢(shì)種群，比如Rhizoctoniasolani和Fusariumsp.等土傳病原真菌的數(shù)量顯著增加，導(dǎo)致病害大面積發(fā)生，塊莖產(chǎn)量降低[38-40]。健康的微生物區(qū)系是高產(chǎn)高效土壤的重要特征，同時(shí)具有抑制土傳病害的作用[41]。因此，連續(xù)長(zhǎng)期大量施氮可能會(huì)抑制土壤中有益真菌微生物群落的生長(zhǎng)，對(duì)土壤健康造成負(fù)面影響。結(jié)果表明，增加施氮量將會(huì)改變真菌群落的組成，并且通過(guò)促進(jìn)致病真菌群落的豐度，可能對(duì)植物健康產(chǎn)生負(fù)面影響。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期大量施氮使馬鈴薯根際硝態(tài)氮大量積累，且氮肥過(guò)量施用降低了土壤pH值，進(jìn)而改變了根際真菌群落結(jié)構(gòu)，過(guò)量施氮使真菌群落豐富度及多樣性降低，RDA及相關(guān)性分析結(jié)果表明硝態(tài)氮含量是影響真菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要理化因子。長(zhǎng)期過(guò)量施氮增加了根際土壤真菌病原菌的相對(duì)豐度，可能會(huì)加劇植物病害以及危害土壤健康，同時(shí)過(guò)量施氮導(dǎo)致了馬鈴薯產(chǎn)量下降。因此，大量施氮不利于馬鈴薯產(chǎn)量的增加和根際土壤真菌生態(tài)系統(tǒng)的平衡。