李文斌，尚興樸，陳彩霞，羅琳，閆濱濱，鄧庭偉，侯俊玲，4*，王文全，，4*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.中國中藥有限公司，北京 100195；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；4.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 102488；

種子種苗是中藥材生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，優(yōu)良品種及優(yōu)質(zhì)的種子種苗是實現(xiàn)中藥材規(guī)范化生產(chǎn)的基礎(chǔ)和首要條件[1]。目前，中藥材種子種苗生產(chǎn)與流通存在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺乏或不完善、經(jīng)營不規(guī)范的問題，與農(nóng)作物、煙草種、草種等的品種選育和種子種苗標(biāo)準(zhǔn)化的進程相比還非常落后。而中藥材質(zhì)量的穩(wěn)定需要中藥材生產(chǎn)的規(guī)范化，中藥材生產(chǎn)的規(guī)范化需要中藥材種子種苗生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化。隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，中藥材種子種苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的重要程度日益顯現(xiàn)。

甘草為豆科多年生植物，以根和根莖入藥，為我國常用大宗藥材。目前，栽培甘草已經(jīng)成為甘草藥材商品的主流，種植方式主要為種子直播與種苗移栽，而質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)的缺乏與不完善也是導(dǎo)致甘草藥材質(zhì)量不穩(wěn)定的重要原因[2-3]。因此，對全國主產(chǎn)區(qū)所流通的甘草種子、種苗開展質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)的研究，以期為甘草藥材的規(guī)范化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)與指導(dǎo)。

1 材料

1.1 種子材料

甘草種子于2016年9月分別搜集于內(nèi)蒙古、甘肅、新疆等地，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所王文全教授鑒定為甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的種子。種子產(chǎn)地來源信息見表1。

1.2 種苗材料

2017年4—6月，對我國甘草主要分布區(qū)的生產(chǎn)用種苗進行收集、調(diào)查，收集到8個批次的甘草種苗樣品，共4994株，收集數(shù)據(jù)1600組。經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所王文全教授鑒定為甘草G.uralensisFisch.的種苗。種苗產(chǎn)地來源信息見表2。

表1 甘草種子的來源信息

注：A.中藥材專業(yè)市場收集；B.地方商戶收集；C.藥材產(chǎn)地收集；D.從植株直接采集。

表2 甘草種苗的產(chǎn)地信息

2 方法

2.1 產(chǎn)量與質(zhì)量指標(biāo)的收集方法

甘草種子的發(fā)芽率、凈度、千粒質(zhì)量、含水量的測定方法參照GB/T 3543.1—3543.7《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》與于福來等[4]的研究結(jié)果。使用卷尺與游標(biāo)卡尺分別測量種苗的根長與蘆頭直徑(蘆頭下1 cm處直徑)，鉤秤測定百株質(zhì)量。參考金燕清等[5]的測定方法測定甘草酸、甘草苷的相對含量。

2.2 種子、種苗質(zhì)量分級方法

甘草種子質(zhì)量分級方法采用K-均值聚類法對30份甘草種子的發(fā)芽率、凈度2個質(zhì)量指標(biāo)數(shù)據(jù)進行K-均值聚類分析。含水量采用標(biāo)準(zhǔn)差法。

甘草種苗質(zhì)量分級方法，根長和蘆頭直徑采用標(biāo)準(zhǔn)差法，平均值加1倍的標(biāo)準(zhǔn)差作為一、二等的分界點，平均值作為二、三等的分界點，平均值減1倍標(biāo)準(zhǔn)差為三等的下限點。百株質(zhì)量采用平均值法，各級種苗的百株質(zhì)量平均值作為各級種苗的上限，對所調(diào)查種苗樣本進行初步分級。所得數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2.3 田間試驗布置

根據(jù)實驗室分級結(jié)果，分別選擇一、二、三級以及混合等級種子進行田間比較試驗。試驗地點設(shè)于北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所試驗田，砂質(zhì)壤土。小區(qū)面積2 m2，3次重復(fù)。采用條播方式，行距15 cm，用種量約700粒/小區(qū)。小區(qū)間設(shè)置20 cm為保護行(隔離區(qū))。2017年10月上旬對影響甘草藥材產(chǎn)量的根系參數(shù)進行調(diào)查。每個小區(qū)取15株用于根參數(shù)調(diào)查，并對單株質(zhì)量及單位面積的藥材產(chǎn)量進行統(tǒng)計。

根據(jù)種苗初步分級結(jié)果，分別選擇一、二、三級以及等外等級種苗進行田間比較試驗。試驗地點設(shè)在甘肅民勤農(nóng)田地，砂質(zhì)壤土。小區(qū)面積2 m2，3次重復(fù)。各等級種苗采用平栽方式，行距15 cm，每個小區(qū)100株。小區(qū)間設(shè)置20 cm為保護行(隔離區(qū))。為了降低由于出苗率導(dǎo)致的株行距改變帶來的影響，于2017年7月下旬利用儲備的同一批材料進行補栽。2017年7月下旬對出苗率進行調(diào)查。分別于2017年10月上旬、2018年10月上旬進行取樣，每小區(qū)取10株用于根參數(shù)調(diào)查，并對單株質(zhì)量及單位面積的藥材產(chǎn)量進行統(tǒng)計。

3 結(jié)果與分析

3.1 甘草種子質(zhì)量分級

3.1.1種子質(zhì)量分級指標(biāo)的確定 發(fā)芽率、含水量、凈度、千粒質(zhì)量、純度、生活力等指標(biāo)常在甘草種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定中被使用(見表3)[6]。其中，發(fā)芽率是甘草發(fā)芽能力的重要指標(biāo)，是種子內(nèi)在質(zhì)量的反映，為種子等級劃分的決定性指標(biāo)。凈度是反映甘草商品性狀的重要指標(biāo)，在甘草種子的流通中，經(jīng)?；煊写罅康碾s質(zhì)，給生產(chǎn)帶來嚴(yán)重影響，因此適當(dāng)提高凈度標(biāo)準(zhǔn)有利于甘草種子商品質(zhì)量的整體提高。甘草千粒質(zhì)量受種質(zhì)影響大，不同種質(zhì)千粒質(zhì)量差異顯著[7]。含水量受氣候影響大，主要影響種子貯藏。因此，選擇發(fā)芽率、含水量作為甘草種子質(zhì)量分級的主要指標(biāo)，千粒質(zhì)量和含水量作為重要的定性指標(biāo)。

表3 甘草種子的部分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

3.1.2種子質(zhì)量分級 通過測定30份甘草種子的發(fā)芽率、凈度、千粒質(zhì)量和含水量(見表4)，并采用K-均值聚類法對30份甘草種子的發(fā)芽率、凈度2個指標(biāo)數(shù)據(jù)進行聚類分析，共分成3類，即3個等級(見表5)，方差分析表明，不同種子間發(fā)芽率、凈度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而不同野生甘草種群種子的千粒質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，含水量與種子貯藏有關(guān)，因此只作為這2項指標(biāo)作為定性指標(biāo)：千粒質(zhì)量的平均值為(10.95±1.33) g，最小值為8.5 g，千粒質(zhì)量一般為8～14 g，因此將8 g作為甘草種子的下限；含水量的平均值為(8.82±1.30)%，因此采用標(biāo)準(zhǔn)差法取其上限10.12%。依據(jù)以上結(jié)果形成草案，以此開展驗證性實驗。結(jié)合驗證實驗結(jié)果、甘草種子流通與生產(chǎn)實際，對種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)草案進行調(diào)整。同時為解決不同等級的等距問題，以使標(biāo)準(zhǔn)更具操作性。將各指標(biāo)尾數(shù)采用05或5-10且逢2.5進位取整法進行修約，并將等外級別舍掉，結(jié)果見表6。

表4 不同來源甘草種子發(fā)芽率、凈度、千粒質(zhì)量及含水量

表5 甘草種子分級指標(biāo)K-均值聚類結(jié)果 %

表6 甘草種子分級標(biāo)準(zhǔn)

3.1.3不同等級種子間產(chǎn)量相關(guān)指標(biāo)的比較 由表7可看出，3個等級間的根系參數(shù)有一定的不同，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各等級單位面積保苗數(shù)與單位面積產(chǎn)量之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且一級>二級>三級。

單位面積產(chǎn)量(g)=單位面積保苗數(shù)(株)× 單株質(zhì)量(g)

(1)

當(dāng)各等級間的單根質(zhì)量相似時，單位面積產(chǎn)量之間的差異來源于單位面積保苗數(shù)的差異。

單位面積保苗數(shù)(株)=[單位面積播種量(g)× 凈度(%)×發(fā)芽率(%)×出苗率(%)]/ 千粒質(zhì)量(g)

(2)

可見發(fā)芽率、凈度與單位面積保苗數(shù)呈正相關(guān)。因此發(fā)芽率和凈度不同的不同等級甘草種子，通過影響單位面積保苗數(shù)，最終影響單位面積產(chǎn)量。

3.2 甘草種苗質(zhì)量分級

3.2.1種苗質(zhì)量分級指標(biāo)的確定 根長、蘆頭下1 cm處直徑、蘆頭下20 cm處直徑、單株質(zhì)量為與藥材產(chǎn)量相關(guān)的重要指標(biāo)[8-9]，根長、蘆頭下1 cm直徑、蘆頭下20 cm直徑用于描述種苗和藥材的形態(tài)，單株質(zhì)量則直接與產(chǎn)量相關(guān)。但蘆頭下20 cm直徑與單株質(zhì)量的測量在實際生產(chǎn)中不易操作，在種苗采購中百株質(zhì)量為1項重要指標(biāo)，常用來計算1批種苗的平均單株質(zhì)量。因此采用根長、蘆頭下1 cm直徑、百株質(zhì)量這3個指標(biāo)用于甘草種苗的質(zhì)量分級。

3.2.2種苗質(zhì)量分級 測定1600株甘草種苗根長和蘆頭直徑，結(jié)果顯示：平均蘆頭直徑為(0.59±0.24) cm，平均根長為(35.84±9.59) cm，可見，甘草種苗在不分級的情況下，不同個體在蘆頭直徑和根長指標(biāo)方面相差很大。按照2.2項下方法進行分級，甘草種苗各等級的實際頻數(shù)分布顯示(見表8)，一級苗為9.22%，二級苗為30.69%，三級苗為35.79%，等外苗為24.30%，合格率為75.70%，種苗各等級所占比例、合格率與種源、密度、田間管理有關(guān)，其中，內(nèi)蒙種源種苗合格率高于較新疆種源種苗、一級種苗率。根長和蘆頭直徑采用標(biāo)準(zhǔn)差

表7 不同等級種子間產(chǎn)量相關(guān)指標(biāo)

注：處理間多重比較采用LSD法。同列字母表示P<0.05。下同。

表8 甘草種苗各樣本的指標(biāo)分布情況

法，百株質(zhì)量采用平均值法，各級種苗的百株質(zhì)量平均值作為各級種苗的上限，為了限定三級苗百株質(zhì)量的下限，設(shè)置8批種苗中的三級苗的最小值0.20 kg作為三級苗的下限。依據(jù)種苗根長、蘆頭直徑以及百株質(zhì)量的測定結(jié)果進行初步分級，依據(jù)以上結(jié)果形成草案，以此開展驗證性實驗。結(jié)合驗證實驗結(jié)果甘草種苗流通和生產(chǎn)實際，對種苗等級初步聚類結(jié)果進行調(diào)整，結(jié)果見表9。

表9 甘草種苗質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)

3.2.3不同等級種苗間產(chǎn)量相關(guān)指標(biāo)的比較 由表10可知，不同等級的種苗的出苗率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=199.42)，隨著等級的下降，出苗率逐漸下降。不同等級的種苗在移栽1年后的藥材在根長、蘆頭直徑、單株質(zhì)量3個指標(biāo)方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義：一級、二級、三級種苗的根長差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但均與等外等級差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.64)；前三級與等外的蘆頭直徑差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=43.53)；各級的單株質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=64.41)，且一級>二級>三級>等外。各級在單位面積的產(chǎn)量間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=464.99)，二級和三級差異無統(tǒng)計學(xué)意義，原因是二級種苗的株數(shù)為41株，三級種苗為48株，屬于取樣帶來的誤差，但二級種苗單位面積產(chǎn)量的平均值要大于三級。

表10 移栽1年后不同等級種苗間產(chǎn)量相關(guān)指標(biāo)

表11 移栽2年后不同等級種苗間產(chǎn)量相關(guān)指標(biāo)

由表11可知，不同等級的種苗在移栽2年后的藥材在根長、蘆頭直徑、單株質(zhì)量3個指標(biāo)方面存在差異有統(tǒng)計學(xué)意義：一級、二級、三級種苗的根長差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但均與等外等級差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.26，P<0.028 0)；前三級與等外的蘆頭直徑差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.53)，且一級>二級>三級>等外；在單株質(zhì)量方面，各等級差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=44.38)，一級與二級顯著大于三級與等外。各等級在單位面積的產(chǎn)量間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.82)，隨著等級逐級下降。

3.2.4不同等級種苗間質(zhì)量相關(guān)指標(biāo)的比較 據(jù)表12結(jié)果顯示：移栽1年后，不同等級的種苗在甘草酸、甘草苷含量方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義：一級和二級種苗對應(yīng)藥材中的甘草酸含量顯著(F=6.15，P<0.017 9)高于等外種苗對應(yīng)的藥材，前3級甘草酸含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但均值依次下降。前3級甘草苷含量(F=16.54，P<0.000 9)高于等外；移栽2年后，不同等級在甘草酸、甘草苷含量方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義：前3級種苗對應(yīng)藥材中的甘草酸含量顯著(F=35.61)高于等外種苗對應(yīng)的藥材，一級和二級的甘草酸含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與三級、等外相比均值依次下降；不同等級中甘草苷含量差異規(guī)律與甘草酸差異規(guī)律相似(F=69.44，P<0.000 1)?？梢?，不同等級種苗移栽1年和2年后，前3級種苗所對應(yīng)的藥材質(zhì)量均優(yōu)于等外等級。

表12 不同等級種苗間質(zhì)量相關(guān)指標(biāo) %

3.2.5不同等級種苗的綜合評價 利用主成分分析法分別對不同等級種苗移栽1年與移栽2年后藥材的產(chǎn)量與質(zhì)量進行綜合評價。對不同等級種苗移栽1年藥材的4個產(chǎn)量相關(guān)指標(biāo)、2個質(zhì)量相關(guān)指標(biāo)以及出苗率指標(biāo)進行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，將7個指標(biāo)簡化為2個因子，累計貢獻率達97.67%，包含了7個指標(biāo)的絕大部分信息。計算各等級種苗的主成分得分，依次為2.26、0.82、-0.54、-2.54，即在出苗率、產(chǎn)量、質(zhì)量3個方面的綜合評價中一級種苗最高，二級和三級種苗依次次之，且均高于等外種苗。

利用相同方法對不同等級種苗移栽2年后藥材的4個產(chǎn)量相關(guān)指標(biāo)、2個質(zhì)量相關(guān)指標(biāo)進行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，將6個指標(biāo)簡化為1個因子，累計貢獻率達93.20%，包含了6個指標(biāo)的絕大部分信息。計算各等級種苗的主成分得分，依次為2.66、0.94、-0.72、-2.88，即在產(chǎn)量、質(zhì)量2個方面的綜合評價中一級種苗最高，二級和三級種苗依次次之，且均高于等外種苗。

4 結(jié)論與討論

甘草種子質(zhì)量等級劃分為3個等級，各級甘草種子的千粒質(zhì)量不低于8 g，含水量不低于10%，一級種子：發(fā)芽率≥90%，凈度≥90%；二級種子：90%>發(fā)芽率≥85%，90%>凈度≥85%；三級種子：85%>發(fā)芽率≥80%，85%>凈度≥80%，經(jīng)驗證，甘草種子質(zhì)量等級劃分合理，以上3個等級的種子規(guī)定為合格種子，在實際生產(chǎn)中定級時，任一指標(biāo)不滿足最低等級時，定為不合格種子，指標(biāo)不能同時滿足同一等級標(biāo)準(zhǔn)要求時，按照最低指標(biāo)滿足的等級進行定級，例如：千粒質(zhì)量和含水量滿足要求，發(fā)芽率為95%，凈度為82%時，則定為三級種子。與孫群等[6]、張國榮等[10]的研究結(jié)果相比，只將發(fā)芽率與凈度作為等級劃分的指標(biāo)，簡化了檢測步驟，更便于在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用。甘草種子等級主要影響單位面積保苗數(shù)，后期的生長將受到株行距改變的影響，單株質(zhì)量會產(chǎn)生一定的差異，但在規(guī)范的田間管理下，種植3年后的產(chǎn)量依然是受保苗數(shù)的影響較大。

甘草種苗質(zhì)量等級劃分為3個等級，一級種苗：根長≥45 cm，蘆頭直徑≥0.8 cm，1.3 kg≤百株質(zhì)量<0.8 kg；二級種苗：45 cm>根長≥35 cm，0.8 cm>蘆頭直徑≥0.6 cm，0.8 kg≤百株質(zhì)量<0.4 kg；三級種苗：35 cm>根長≥25 cm，0.6 cm>蘆頭直徑≥0.4 cm，0.4 kg≤百株質(zhì)量≤0.2 kg，經(jīng)驗證，甘草種苗質(zhì)量等級劃分合理，以上3個等級的種苗規(guī)定為合格種苗，在實際生產(chǎn)中定級時，種苗的根長和蘆頭直徑作為分級操作的參照指標(biāo)，而百株質(zhì)量作為分級操作后檢測復(fù)查的參照指標(biāo)，當(dāng)任一指標(biāo)超出質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)范圍時，定為不合格種苗，指標(biāo)不能同時滿足同一等級標(biāo)準(zhǔn)要求時，按照最低指標(biāo)滿足的等級進行定級。同時，通過移栽后1年和移栽后2年的數(shù)據(jù)進行對比，發(fā)現(xiàn)其研究結(jié)果一致，說明已經(jīng)分級的種苗在合理的采收年限內(nèi)，不存在越級的情況。在田間對比試驗中并未使用肥料，移栽2年后的藥材，一級和二級的甘草酸和甘草苷含量均符合《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，等外的甘草酸和甘草苷含量則未達《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，三級雖未達標(biāo)，但其含量均接近《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。金燕清等[5]和張豆豆等[11]的研究結(jié)果顯示，通過合理配施氮磷鉀肥料可以有效提高甘草酸和甘草苷的含量與藥材產(chǎn)量。可見，在規(guī)范的田間管理下合格種苗在移栽2年后均可以符合《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。