劉長旭 賀 余 劉 昶

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院普外科，哈爾濱 150001)

胃癌是常見的惡性腫瘤，預(yù)后較差。我國是胃癌高發(fā)國家，發(fā)病和死亡數(shù)均約占世界的50%[1]。盡管醫(yī)學(xué)水平在不斷進(jìn)步，腹腔鏡胃癌根治術(shù)也日趨成熟[2，3]，但由于淋巴管是胃癌轉(zhuǎn)移的常見途徑，如果淋巴結(jié)清掃不徹底，極易發(fā)生復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移[4]，腹腔鏡手術(shù)胃癌的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率較開腹手術(shù)并未顯著下降[5]。

人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，且胃癌的原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中HER-2蛋白所表達(dá)的狀態(tài)具有高度的一致性[6，7]，因此，HER-2可以為胃癌的靶向治療提供良好的依據(jù)[8]。量子點(diǎn)作為新興的納米熒光探針材料，因優(yōu)良的光學(xué)特性被廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)標(biāo)記[9，10]。若將HER-2作為胃癌的治療靶點(diǎn)，利用量子點(diǎn)納米熒光探針對其進(jìn)行標(biāo)記，癌腫范圍以及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)便可以準(zhǔn)確地被標(biāo)記出來。利用改裝后的熒光腹腔鏡直視下根據(jù)組織散發(fā)的熒光更好地辨認(rèn)腫瘤及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，還可以顯示常規(guī)腹腔鏡難以覺察的其他組織轉(zhuǎn)移，最終可以在術(shù)中熒光導(dǎo)航輔助下精準(zhǔn)切除腫瘤。Metildi等[11]進(jìn)行小鼠胰腺腫瘤的熒光腹腔鏡成像，Murayama等[12]應(yīng)用5-鹽酸氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)標(biāo)記人體胃癌進(jìn)行熒光腹腔鏡下分期。本研究旨在找到能與胃癌組織特異性結(jié)合的熒光探針，在術(shù)中實(shí)時觀察腫瘤形態(tài)，為腫瘤精準(zhǔn)切除提供導(dǎo)航輔助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

胃癌細(xì)胞株NCI-N87購買于武漢普諾賽生命科技有限公司。由量子點(diǎn)和HER-2單克隆抗體結(jié)合制成的量子點(diǎn)納米熒光探針由杭州納晶科技有限公司提供)，裸鼠(18～22 g)購買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[批文號：SCXK(京)2016-0006]。

1.2 組建熒光腹腔鏡系統(tǒng)

以O(shè)lympus公司VISERA OTV-S190作為主機(jī)，匹配VISERA CLV-S190光源和OEV262H顯示器，使用天津博朗科技發(fā)展有限公司腔鏡鏡頭(直徑2.7 mm)作為觀察裸鼠腹腔的成像設(shè)備，與主機(jī)連接，在鏡頭與光源線連接處安置一個特制濾光片(FU-532LGP-Y7，深圳市富喆科技有限公司)，該濾光片濾光波長范圍450～500 nm，符合量子點(diǎn)納米熒光探針的激發(fā)波長要求，連接光源，熒光腹腔鏡系統(tǒng)初步組建完成。

1.3 裸鼠胃癌模型的制備

將20只3～4周齡，體重20 g左右的裸鼠在無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級動物飼養(yǎng)間飼養(yǎng)3～5 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取2只裸鼠，用1 ml注射器吸取配制好的胃癌細(xì)胞懸液0.2 ml，固定裸鼠，在裸鼠右后肢進(jìn)針，針尖斜面向上，確定位置合適后緩慢推進(jìn)全部胃癌細(xì)胞懸液，皮下形成皮丘，拔針后用醫(yī)用棉球按壓針眼數(shù)秒以確保液體全部進(jìn)入，放回籠內(nèi)，裸鼠皮下種瘤完成。取12只裸鼠，每只肌肉注射舒泰1 mg給予全身麻醉，觀察無麻醉反應(yīng)后，在裸鼠腹中線旁約0.2 cm處取切口開腹后，充分游離暴露胃部，將同等劑量的胃癌細(xì)胞懸液注射于胃黏膜下，注意不要將細(xì)胞懸液漏入腹腔，關(guān)閉腹腔，縫合皮膚，碘伏棉球消毒后敷料固定，待其清醒后放入籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)，裸鼠胃內(nèi)腫瘤種植完成。余6只為健康裸鼠。由于胃內(nèi)接種不便于觀察成瘤情況，可以每日觀察裸鼠的背部成瘤情況進(jìn)行初步對照，1周后當(dāng)瘤體直徑達(dá)到1 cm左右即可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)觀察。

1.4 動物分組和實(shí)驗(yàn)操作

將12只胃內(nèi)種植胃癌細(xì)胞的裸鼠模型分為A、B組(每組6只)，正常生長的健康裸鼠作為C組。將濃度為1 μmol/L的量子點(diǎn)熒光探針從4 ℃冰箱取出，用PBS溶液稀釋20倍[13]，使?jié)舛茸優(yōu)?.05 μmol/L，避光保存，用于尾靜脈注射備用。1 ml注射器吸取稀釋后的量子點(diǎn)納米熒光探針100 μl推入A組裸鼠尾靜脈，B組裸鼠尾靜脈先緩慢推入100 μl 0.5 μmol/L Her-2基因自身抗體進(jìn)行抗體封閉，1 h后于尾靜脈推入同A組完全相等劑量的量子點(diǎn)熒光探針。向C組正常生長的裸鼠尾靜脈同樣推入相等劑量的熒光探針，觀察15 min左右待探針完全進(jìn)入血液循環(huán)并與腫瘤相結(jié)合后將裸鼠進(jìn)行全身麻醉(舒泰1 mg/只，肌肉注射)，麻醉全程注意裸鼠保暖。將裸鼠固定于操作臺上，下腹正中開一約0.2 cm切口，鉤鑷提起腹壁，將改裝后的熒光腹腔鏡設(shè)備進(jìn)入裸鼠腹腔觀察，在胃區(qū)及周圍臟器和淋巴結(jié)進(jìn)行集中照射，激發(fā)探針使其發(fā)光，隨即將光源亮度調(diào)至最低，觀察有無發(fā)光區(qū)域。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，量子點(diǎn)熒光探針的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)拋物線變化，1 h后熒光強(qiáng)度達(dá)到最高，以后逐漸衰減，30 h后熒光全部消失，我們按照15、30 min，1、2、4、8、12、24、30 h時間點(diǎn)進(jìn)行觀察研究。觀察結(jié)束后，將裸鼠全部處死，解剖裸鼠，將發(fā)光組織進(jìn)行切片處理，送檢切片行HE染色和免疫組化，以證實(shí)發(fā)光組織是否為胃癌組織，以及是否高表達(dá)HER-2蛋白。

2 結(jié)果

A組裸鼠注射探針后在白光和熒光腹腔鏡下成像對比，白光下雖然亮度足夠，但不易觀察到腫瘤的位置，降低光源亮度后，發(fā)熒光的腫瘤可以清晰地辨認(rèn)出來(圖1)。B組裸鼠由于提前注射單克隆抗體，抗體與腫瘤結(jié)合，導(dǎo)致探針無法聚集于癌腫部位，熒光腹腔鏡下未見明顯發(fā)光(圖2)。C組裸鼠由于體內(nèi)未種植胃癌細(xì)胞，探針經(jīng)尾靜脈入血后無法大量聚集，腹腔鏡下未見其發(fā)光(圖3)。如圖4所示，A、B、C、D分別為被探針標(biāo)記的胃癌組織在1、4、8、12 h后熒光顯像，隨著時間的延長量子點(diǎn)熒光探針的熒光強(qiáng)度在逐漸減弱。將裸鼠處死后解剖胃部，取發(fā)光組織切片進(jìn)行HE染色，鏡下證實(shí)發(fā)光組織即為胃癌(圖5)。將發(fā)光的胃癌組織切片進(jìn)行細(xì)胞角蛋白免疫組化染色，證實(shí)該胃癌高表達(dá)HER-2蛋白(圖6)。

3 討論

胃癌是全球范圍內(nèi)較為常見的惡性腫瘤，患病率和死亡率一直居高不下[14]，許多患者在確診時即已處于晚期。胃癌由于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致難以根治，腫瘤準(zhǔn)確切除以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的清掃可以使復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率大大降低。目前，手術(shù)是治療胃癌的主要手段。隨著醫(yī)學(xué)水平的進(jìn)步，腹腔鏡胃癌根治術(shù)已經(jīng)廣泛被應(yīng)用[15]，盡管創(chuàng)傷小，術(shù)后恢復(fù)快[16]，在手術(shù)過程中仍無法對癌腫位置進(jìn)行準(zhǔn)確判斷，常常需要聯(lián)合胃鏡或者術(shù)前定位，使胃癌的切除不夠精準(zhǔn)。本研究利用量子點(diǎn)熒光探針能與胃癌細(xì)胞結(jié)合并發(fā)光的特性，組建量子點(diǎn)熒光腹腔鏡系統(tǒng)，能夠術(shù)中實(shí)時觀察癌腫部位以及是否有其他臟器及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，為胃癌的精準(zhǔn)治療提供理論基礎(chǔ)與實(shí)踐支持。

HER-2在胃癌組織中的高表達(dá)為熒光腹腔鏡的靶向治療提供新的思路。HER-2在很多癌癥中存在高表達(dá)或過表達(dá)，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌及卵巢癌等，在胃癌中也同樣存在過表達(dá)[17]，而且通常會導(dǎo)致預(yù)后不良。本研究選用高表達(dá)HER-2的NCI-N87胃癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi)。量子點(diǎn)由于獨(dú)特的熒光特性，已逐漸應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中[18]。相比于其他有機(jī)染料(如5ALA、ICG)，量子點(diǎn)激發(fā)光譜寬，熒光時間長、強(qiáng)度高[19]，在活體生物成像方面具有很大的優(yōu)勢。本研究選用硒化鎘(CdSe)作為內(nèi)部核心結(jié)構(gòu)，外部包裹硫化鋅(ZnS)制成量子點(diǎn)，結(jié)合HER-2單克隆抗體制備成量子點(diǎn)納米熒光探針。利用硫化鋅作為外殼既可以減少鎘離子的釋放，也可以避免量子點(diǎn)發(fā)生氧化，減少自由基的產(chǎn)生[20]，從而進(jìn)一步減輕量子點(diǎn)的毒性。將該探針與胃癌細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)結(jié)合，再利用熒光腹腔鏡設(shè)備進(jìn)行觀察，即可對量子點(diǎn)熒光探針的光學(xué)特性以及熒光腹腔鏡的優(yōu)勢進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

在NCI-N87細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的生長速度較快，復(fù)蘇后第1天即可鋪滿培養(yǎng)瓶底部。傳代幾次后，將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞注射于裸鼠胃壁內(nèi)，為保證成瘤率，建議將胃癌細(xì)胞懸液注射于裸鼠胃大彎側(cè)，近胃竇處，注射完畢后用4-0小兒胃腸外科絲線縫合皮膚。此方法操作簡單，安全性高，但由于腫瘤種植于胃內(nèi)不便于觀察是否成瘤以及瘤體大小，而且成瘤周期長，成瘤率也比組織塊法低[21]，所以在裸鼠右后肢皮下以同法種植進(jìn)行對照觀察，這樣可以證實(shí)胃癌細(xì)胞的活性。且一旦懸液接種法成瘤失敗，可以解剖裸鼠皮下的腫瘤進(jìn)行組織塊包埋法使實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。Sprague等[22]研究表明將細(xì)胞懸液與膠原溶液混合共同注射于裸鼠體內(nèi)可提高成瘤率。在上述操作中，均要嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則，在SPF級動物飼養(yǎng)間內(nèi)的通風(fēng)櫥中進(jìn)行，避免裸鼠發(fā)生切口感染等并發(fā)癥。

裸鼠種瘤7 d后，裸鼠背部腫瘤直徑已經(jīng)達(dá)到1 cm，少數(shù)已達(dá)2 cm，甚至出現(xiàn)破潰。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)表明，此時胃內(nèi)腫瘤的直徑可以達(dá)到0.5 cm，可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。由于熒光探針中含有鎘離子，所以我們將其稀釋20倍以減輕毒性反應(yīng)，尾靜脈注射后觀察15 min，裸鼠無明顯不良反應(yīng)發(fā)生，同時在此期間，也可以讓熒光探針充分進(jìn)行血液循環(huán)，與胃癌組織進(jìn)行有效的結(jié)合。麻醉選用誘導(dǎo)時間短，安全性高且不抑制呼吸肌的全身麻醉藥物[23]，同時麻醉過程中應(yīng)注意裸鼠的保暖，在裸鼠下面可以放置紗布，防止熱量散失過快。腔鏡進(jìn)入后可以清晰地觀察到裸鼠的腹腔臟器，但胃部形態(tài)無明顯異常，在白光照射下無法準(zhǔn)確地判斷出腫瘤的具體位置，在胃區(qū)和周圍臟器、淋巴結(jié)進(jìn)行充分照射，激發(fā)探針發(fā)出熒光，然后將光源亮度調(diào)至最低，可以看到小鼠胃部出現(xiàn)較為明顯的熒光。B、C組由于探針無法聚集，并未出現(xiàn)熒光顯像，驗(yàn)證前期實(shí)驗(yàn)中量子點(diǎn)熒光探針無法結(jié)合正常胃組織的結(jié)論，同時也排除A組假陽性的可能。由于量子點(diǎn)半衰期長，所以我們注射探針后在不同時間點(diǎn)進(jìn)行了熒光強(qiáng)度的觀察?？梢钥吹?5 min后熒光強(qiáng)度逐漸增高，在1 h時可以看到發(fā)光的腫瘤組織熒光強(qiáng)度很高，腫瘤的部位、大小以及形狀均可以較好的辨認(rèn)出來，同時也可以在這個時間點(diǎn)判斷有無其他臟器或淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移；4 h后熒光強(qiáng)度開始衰減，但仍能較清晰地看見腫瘤的形態(tài)；8 h后熒光強(qiáng)度繼續(xù)減弱，12 h后腫瘤組織的熒光仍未消失，足以滿足一臺腹腔鏡胃癌手術(shù)的時間需要，直到30 h后熒光才全部消失，而且可以證實(shí)熒光探針可以在裸鼠體內(nèi)與胃癌組織穩(wěn)定結(jié)合。觀察完成后對裸鼠進(jìn)行解剖，取發(fā)光組織進(jìn)行病理學(xué)檢查及免疫組化檢測，證實(shí)發(fā)光組織即為與探針結(jié)合的胃癌組織且高表達(dá)HER-2蛋白。

圖1 白光與熒光腹腔鏡下胃癌組織的成像比較，熒光狀態(tài)下腫瘤可以清晰地辨認(rèn)出來(最后一列為局部放大3倍后的成像效果) 圖2 抗體封閉后的胃癌組織成像比較，抗體封閉后熒光腹腔鏡下未見明顯發(fā)光 圖3 正常裸鼠注射探針后胃癌組織的成像比較，由于探針未大量聚集，腹腔鏡下未見發(fā)光 圖4 胃癌組織的熒光衰減，隨著時間延長，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，12 h后熒光強(qiáng)度衰減至1/3，足以滿足一臺腔鏡胃癌手術(shù)的時間要求 A.1 h后熒光圖像；B.4 h后熒光圖像；C.8 h后熒光圖像；D.12 h后熒光圖像(20 h后熒光完全消失) 圖5 顯微鏡下胃癌組織革蘭氏染色，可見中分化異型腺體(A. ×80；B. ×200) 圖6 顯微鏡下胃癌角蛋白免疫組化染色，證實(shí)為HER-2陽性胃癌細(xì)胞(A. ×80；B. ×200)

本研究成功應(yīng)用量子點(diǎn)和HER-2單克隆抗體完成熒光探針的制備，并證實(shí)其能與高表達(dá)HER-2蛋白的胃癌組織進(jìn)行特異性結(jié)合，初步完成熒光腹腔鏡的改造，制備出合適尺寸和波長范圍的玻璃濾光片，使量子點(diǎn)熒光探針成功發(fā)光，完成胃癌在量子點(diǎn)熒光腹腔鏡下的可視化成像，驗(yàn)證了熒光腹腔鏡較普通腹腔鏡更容易發(fā)現(xiàn)腫瘤組織以及其它不易被察覺的轉(zhuǎn)移。未特異性結(jié)合的量子點(diǎn)會進(jìn)入到其他器官引發(fā)毒性效應(yīng)[24]，主要為腎毒性，雖然有硫化鋅作為封蓋材料，但是其本身的鎘離子毒性也應(yīng)考慮在內(nèi)，因此，量子點(diǎn)熒光探針的生物毒性限制其廣泛地應(yīng)用于人體，合適的探針濃度和劑量還需要進(jìn)一步在實(shí)驗(yàn)中探索。如果解決它的毒性問題，必將產(chǎn)生巨大的醫(yī)療前景，對量子點(diǎn)熒光腹腔鏡應(yīng)用于胃癌的精準(zhǔn)治療產(chǎn)生推動作用。綜上所述，量子點(diǎn)熒光腹腔鏡可以為消化道腫瘤患者術(shù)中導(dǎo)航精準(zhǔn)切除腫瘤、輔助化療以及判斷預(yù)后奠定基礎(chǔ)，為胃腸道腫瘤的治療提供新的思路。