牛會(huì)曉，謝雙霞，薛園園

（許昌市人民醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護(hù)病房，河南 許昌 461000）

流行病學(xué)研究表明,我國(guó)部分地區(qū)先天性心臟病的發(fā)病率可接近485～686/1萬(wàn)人左右[1]。臨床上先天性心臟病的發(fā)生,能夠?qū)е禄颊邜盒孕难芙Y(jié)局事件的發(fā)生，增加了患者的病死率可能[2,3]?，F(xiàn)階段臨床上缺乏對(duì)于先天性心臟病病情評(píng)估的可靠性指標(biāo)，而對(duì)于相關(guān)病情評(píng)估性指標(biāo)的研究，能夠指導(dǎo)臨床上先天性心臟病患者的診療和臨床預(yù)后評(píng)估工作。腦鈉肽(BNP)是心房細(xì)胞分泌的糖蛋白，其表達(dá)濃度的上升能夠反應(yīng)心臟的順應(yīng)性改變，評(píng)估心肺循環(huán)障礙的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[4]；肌鈣蛋白（cTnI）是反應(yīng)心肌細(xì)胞膜完整性的指標(biāo),在心肌細(xì)胞損傷或者膜完整性破壞的患者中，cTnI的表達(dá)濃度可明顯的上升[5]；喬治綜合癥危象基因（DGCR8）的表達(dá)濃度的上升,能夠通過(guò)影響到心血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化成熟，促進(jìn)心臟內(nèi)膜下心肌細(xì)胞的發(fā)育，抑制心臟的重塑性改變,降低先天性心臟病的病情進(jìn)展速度[6]。 為了揭示 BNP、cTnl、DGCR8 的表達(dá)與先天性心臟病患者的病情關(guān)系,從而為臨床上相關(guān)患者的病情評(píng)估提供參考,本次研究選擇2016年1月-2018年1月我院兒科收治的106例先天性心臟病患兒為觀察組,探討了BNP、cTnl、DGCR8的表達(dá)及其與患兒的病情關(guān)系，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月-2018年1月我院兒科收治的106例先天性心臟病患兒為觀察組，其中男50例、女46例，年齡2個(gè)月～24個(gè)月，同期健康體檢兒童160例為對(duì)照組,其中男89例，女71例，年齡1月～12歲,兩組患者在性別、年齡等一般資料方面無(wú)明顯差異(P＞0.05)，具有可比性。觀察組患兒中室間隔缺損16例,房間隔缺損5例，房間隔合并室間隔缺損9例，房室間隔缺損2例，法洛四聯(lián)癥4例，動(dòng)脈導(dǎo)管未閉4例。納入標(biāo)準(zhǔn):無(wú)肝、腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病及腫瘤；健康對(duì)照組血常規(guī)、肝腎功能、心臟超聲等檢查均無(wú)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不完整，治療后無(wú)明顯好轉(zhuǎn)或死亡。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者監(jiān)護(hù)人自愿參與本次研究,并簽署知情同意書。

1.2 分組標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)改良Ross評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)將患者分為三組，分別為無(wú)心力衰竭組（n=11），輕度心衰組（n=45），中度心衰組（n=38）和重度心衰組（n=12）。分組標(biāo)準(zhǔn):無(wú)心力衰竭(0～2 分)，輕度心衰(3～6 分)，中度心衰(7～9 分)，重度心衰(10～12 分)，見(jiàn)表 1。

表1 改良Ross標(biāo)準(zhǔn)

1.3 觀察指標(biāo) 觀察組患兒在入院第2天和治療后穩(wěn)定期分別采集空腹靜脈血1～2 ml,低溫300g離心3min，吸取血清，置-20℃凍存?zhèn)溆?對(duì)照組兒童取清晨空腹靜脈血1～2 ml，處理同觀察組,采用免疫發(fā)光法檢測(cè)所有受試者血清腦鈉肽 (BNP)、肌鈣蛋白（cTnI）濃度，采用RT-PCR法檢測(cè)血清中DGCR8 mRNA的表達(dá)水平。心功能參數(shù)LVEF、LVFS測(cè)量采用多普勒超聲心動(dòng)圖儀，根據(jù)兩組的LVESD和LVEDD計(jì)算出左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)。

1.4 檢測(cè)方法 采集患者的靜脈血3ml,加入BNP、cTnl單抗，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的BNP、cTnl會(huì)與單抗結(jié)合,PBS液體洗滌5min。按照1：500的比例加入羊標(biāo)志的一抗5ml，4℃放置過(guò)夜，PBS緩沖液洗滌3 次，每次 5min，加入鼠來(lái)源的二抗（1：1000）2ml，室溫放置2h，PBS液體洗滌5min。加入顯色底物,辣根過(guò)氧化物酶會(huì)使無(wú)色的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色,加終止液變黃。于450nm處測(cè)OD值。

采集患者的靜脈血，加入0.2ml的氯仿，2℃～8℃ 冰凍離心機(jī)12000 g離心15min,反復(fù)一次洗滌RNA,棄上清,在管底部可見(jiàn)一乳白色小沉淀物，加入1 ml 75%乙醇,0.1%DEPC水溶解。加入DGCR8基因和 GAPDH上下游引物、0.1%DEPC使其終濃度均為 20pmol/μl，制備反應(yīng)體系，RTPCR 擴(kuò)增的條件與參數(shù)：48℃，45min，94℃，2 min；94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2min 共 40 個(gè)循環(huán)； 循環(huán)完畢后 68℃ 延伸 7 min。

檢查儀器為美國(guó)飛利浦公司生產(chǎn)的IE33，儀器探頭設(shè)置為3.5～5.0MHZ,檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及左室短軸收縮率（LVFS）、左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS16.0，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用pearson檢驗(yàn)分析心功能參數(shù) LVEF、LVFS、LVMI 與血清 BNP、cTnl、DGC R8水平相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 先天性心臟病患兒血清BNP、cTnl、DGCR8水平變化 觀察組患兒血清BNP、cTnl水平較對(duì)照組明顯升高，DGCR8 mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表 2。

2.2 不同心功能等級(jí)先心病患兒血清BNP、cTnl、DGCR8水平變化 患兒BNP、cTnl、DGCR8水平在不同心功能等級(jí)組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P均＜0.05，心功能等級(jí)越高，血清中BNP、cTnl水平越高，DGCR8 mRNA表達(dá)越低，見(jiàn)表3。

表2 先天性心臟病患兒血清BNP、cTnl、DGCR8水平變化

表3 不同心功能患兒組血清BNP、cTnl、DGCR8水平比較

2.3 先心病患兒血清BNP、cTnl、DGCR8水平與心功能指標(biāo)相關(guān)性 先心病患兒血清BNP水平與LVEF呈顯著負(fù)相關(guān)，與LVMI呈顯著正相關(guān)；cTnl與LVFS呈顯著負(fù)相關(guān)；DGCR8 mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表4。

3 討論

遺傳性因素、射線及胚胎期不同病理性因素的致畸，均能夠促進(jìn)先天性心臟病的發(fā)生，特別是在合并有相關(guān)心血管先天性疾病家族史的患者中，先天性心臟病的發(fā)生率可進(jìn)一步的上升[7]。臨床上先天性心臟病的發(fā)生,能夠?qū)е禄純荷钯|(zhì)量的顯著下降,并能夠增加肺性腦病、肺動(dòng)脈高血壓、多器官功能衰竭等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3,8]?，F(xiàn)階段臨床上主要通過(guò)心臟超聲檢測(cè)評(píng)估先天性心臟病患者的病情,但一項(xiàng)囊括了203例樣本量的病情評(píng)估分析研究可見(jiàn),依靠心臟超聲檢查評(píng)估先天性心臟病患者病情的一致性率仍然存在一定的局限性,其對(duì)于患兒遠(yuǎn)期心力衰竭或者臨床轉(zhuǎn)歸的預(yù)測(cè)作用不足[9]。而本次研究對(duì)于先天性心臟病患者體內(nèi)BNP、cTnl、DGCR8的表達(dá)分析研究，不僅能夠揭示先天性心臟病的病情進(jìn)展機(jī)制,同時(shí)還能為臨床上相關(guān)患兒的病情評(píng)估提供血清學(xué)方面的參考。

BNP是反應(yīng)患者心力衰竭潛在風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)，由于先天性心臟病患兒,其多數(shù)存明顯的心肺循環(huán)障礙,心臟泵血負(fù)荷的增加，能夠?qū)е滦姆考?xì)胞分泌BNP能力的顯著上升,促進(jìn)了機(jī)械性刺激下BN P的分泌速度[10]；cTnl是反應(yīng)心肌細(xì)胞損傷的指標(biāo),在急性心肌梗塞或者冠脈綜合癥的患者中,cTnl的表達(dá)均可顯著上升。而在先天性心臟病患兒中，由于心臟循環(huán)負(fù)荷的增加,心肌細(xì)胞能量利用代謝的障礙,均能夠?qū)е滦募〖?xì)胞的缺氧缺血性損傷[11]；DGCR8能夠通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者線粒體的微處理器，影響到微小RNA的轉(zhuǎn)錄和合成，進(jìn)而參與到心血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化和成熟過(guò)程。

本次研究探討了BNP、cTnl、DGCR8在心臟病患兒中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在病例組患者血清中，B NP、cTnl的表達(dá)濃度明顯上升,而DGCR8的表達(dá)濃度明顯下降,提示了 BNP、cTnl、DGCR8的差異性表達(dá),均能夠參與到兒童先天性心臟病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。通過(guò)匯集不同的相關(guān)文獻(xiàn)，筆者認(rèn)為這主要由于BNP、cTnl、DGCR8的下列幾個(gè)方面的機(jī)理有關(guān)[12,13]：⑴先天性心臟病患者，心肺循環(huán)的障礙，能夠?qū)е聞?dòng)脈血中血氧飽和度的下降,導(dǎo)致心肌細(xì)胞的缺氧缺血性損傷,進(jìn)而促進(jìn)了心肌細(xì)胞膜的破壞，促進(jìn)了BNP、cTnl的釋放；⑵先天性心臟病患兒,其心血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化障礙和心臟間質(zhì)組織細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控異常，導(dǎo)致DGCR8的合成顯著的不足。杜偉等[14]研究者也認(rèn)為，在心臟病患者中，BNP的表達(dá)濃度可平均上升40%以上,特別是在合并有明顯的肺動(dòng)脈高壓或者肺心病的患者中，BNP的表達(dá)濃度可進(jìn)一步的上升。在探討不同心衰程度的患者相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)過(guò)程中,可以發(fā)現(xiàn)在心衰組特別是重度心衰組患者中，BNP、cTnl的表達(dá)濃度明顯上升,而DGCR8的表達(dá)濃度明顯的下降，提示BNP、cTnl、DGCR8的表達(dá)與先天性心臟病患者的病情嚴(yán)重程度具有密切的關(guān)系,這主要由于心血管系統(tǒng)病情嚴(yán)重程度越高,患兒體內(nèi)的心肌細(xì)胞的損傷程度越為明顯，BNP、cTnl的釋放程度越高[15]。但部分研究者并不認(rèn)為cTnl的表達(dá)與兒童心衰患者的病情存在相關(guān)關(guān)系,存在不同的臨床結(jié)論主要考慮與cTnl的檢測(cè)時(shí)機(jī)或者檢測(cè)方法的不同有關(guān)。左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及左室短軸收縮率（LV FS）、左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)，是評(píng)估患兒心功能的指標(biāo),可以發(fā)現(xiàn) BNP、cTnl、DGCR8的表達(dá)與患兒的心功能水平密切相關(guān),進(jìn)一步提示了BNP、cTnl、DGCR8的表達(dá)與先天性心臟病患者的病情關(guān)系。

綜上所述，在先天性心臟病患者中，BNP、cTnl的表達(dá)濃度明顯上升，DGCR8的表達(dá)明顯下降，同時(shí)BNP、cTnl、DGCR8的表達(dá)與患兒心衰程度及心功能密切相關(guān)。

表4 先心病患兒血清BNP、cTnl水平及DGCR8 mRNA表達(dá)與心功能指標(biāo)相關(guān)性