鄭恩惠 ，林杰 ，柯自立 ，謝芳?xì)J ，徐海濱

（1.福建省疾病預(yù)防控制中心，福建 福州 350001;2.福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001）

致瀉性大腸埃希菌（iarrheagenic E coli，DEC）是引發(fā)感染性腹瀉常見的的腸道致病菌,根據(jù)其所攜帶的毒力因子、致病機(jī)制及流行病學(xué)特征等通常分為5類:腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌(ETEC)、腸出血性大腸埃希菌(EHE C)、腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)和腸聚集性大腸埃希菌(EAEC)[1]。

DEC引發(fā)的腹瀉病是全世界范圍內(nèi)備受關(guān)注的一個(gè)公共衛(wèi)生問題,特別是在發(fā)展中國家，DEC是引起嬰幼兒腹瀉的一種主要致病菌[2]，在臨床診斷難以鑒別,并且容易獲得耐藥基因。所以，能快速檢出DEC,并指導(dǎo)臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥具有重要意義。為此我省開展對(duì)致瀉大腸埃希菌的病原學(xué)監(jiān)測(cè),以掌握其流行情況及耐藥性特征。

1 材料與方法

1.1 菌株 2018年從福建省南平市延平區(qū)和福建省永安市兩個(gè)監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)分離的初步鑒定為大腸埃希菌的菌株共300株。參考菌株：EAEC、O157:H7 EDL933、EIEC、EPEC、ETEC、 ATCC 25922 為本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種。

1.2 試劑和儀器 五種致瀉大腸埃希菌多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒 （深圳市生科原技術(shù)有限公司）。rTaq DNA,聚合酶dNTPs購自大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖為BioAsia進(jìn)口分裝品,PCR擴(kuò)增儀為 G-Storm（英國 Gene Technologies公司）,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為CorbettRotor-Gene6000，凝膠成像分析系統(tǒng)為Molecular Imager Gel Doc XR System（美國Bio-Rad公司）,電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-6C型。

1.3 方法

1.3.1 模板制備 將分離的菌株在普通營養(yǎng)瓊脂上37℃，培養(yǎng)18h～24h，刮取接種環(huán)一滿環(huán)的菌量于100μl滅菌雙蒸水中混勻,煮沸 10min～15min,離心，取上清直接用于PCR擴(kuò)增。

1.3.2 PCR操作方法 提取可疑菌落的DNA，運(yùn)用多重實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行初篩,篩查出陽性基因的標(biāo)本挑取單克隆進(jìn)行單重PCR方法進(jìn)行確認(rèn)。五種致瀉大腸桿菌的相關(guān)檢測(cè)基因有：EAEC的aggR,pic和 astA基因、ETEC的 elstb和 elt基因、EPEC的 escV和 bfp、EHEC的 stx基因、EIEC的ipaH和virA基因[3,4]。多重?zé)晒饧皢沃豍CR的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。單重PCR引物及擴(kuò)增條件參見文獻(xiàn)[4]。

1.3.3 藥敏試驗(yàn) 采用北京天壇的的15種抗生素紙片,包括阿米卡星(AK)、氨芐西林 (AMP)、氨芐西林/舒巴坦(AMS)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢吡肟(CEF)、頭孢哌酮(CFP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢西丁(FOX)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢曲松(CRO)、環(huán)丙沙星（CP）、慶大霉素(GEN)、美羅培南(MER)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、復(fù)方新諾明（SXT）。結(jié)果判定根據(jù) CLSI指南(2018版）標(biāo)準(zhǔn)解釋,按CLSI推薦的ESBLs紙片篩選法和酶抑制劑增強(qiáng)紙片確證法標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定大腸埃希菌中的產(chǎn)ESBLs株。

2 結(jié)果

2.1 致瀉性大腸埃希菌（DEC）檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 DEC分離 從300例腹瀉糞便標(biāo)本中通過多重?zé)晒釶CR方法篩查出致瀉大腸桿菌毒力基因陽性標(biāo)本28例,這28例標(biāo)本經(jīng)過單重PCR方法分離出致瀉性大腸桿菌20株。

2.1.2 DEC分型結(jié)果 2018年5-11月共收到腹瀉糞便標(biāo)本300份,分離出20株致瀉性大腸桿菌，檢出率為6.67%株,其中7株aggr基因陽性，4株astA基因陽性,1株pic陽性,判定為EAEC；4株escV基因陽性，判定為aEPEC；3株estlb基因陽性，1株elt基因陽性,判定為ETEC;未分離出EHEC和EI EC,見表 1。

表1 2018年福建省監(jiān)測(cè)點(diǎn)DEC毒力基因分布情況

2.1.3 DEC的感染特征 6-9月為檢出高峰，共分離出19株；致瀉性大腸桿菌在5歲以下兒童和60歲以上老人中檢出率較高,兩個(gè)年齡組內(nèi)均分離出7株。

2.1.4 藥敏試驗(yàn) 對(duì)20株分離株進(jìn)行了15種常見抗菌藥物敏感性檢測(cè)。其中氨芐西林的耐藥率相對(duì)較高,為 55%;其次是頭孢唑啉,耐藥率為 40%;頭孢噻肟、頭孢曲松、復(fù)方新諾明耐藥率均為 30%，其余測(cè)試的抗菌藥物敏感性較高。見表2。

2.1.5 產(chǎn)ESBLs菌株 判定為ESBLs表型的大腸埃希氏菌共有6株,耐藥率為30%（6/20）,均為EA EC。對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松的耐藥率均高達(dá)100%，對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率為50%。

表2 20株DEC對(duì)15種抗菌藥物的藥敏結(jié)果（%）

3 討論

傳統(tǒng)大腸埃希菌的檢測(cè)與鑒定方法需通過一系列繁復(fù)的增菌，生化，血清鑒定等過程，且不能區(qū)分出是否為DEC。福建省近年來建立起多重普通PCR和多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法來進(jìn)行DEC毒力基因的初篩，胡安妥[5]建立多重實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法檢測(cè)5種致瀉性大腸埃希氏菌,一次性鑒別出多種致瀉性大腸，PCR后無需再進(jìn)行凝膠電泳，操作簡單、高特異性、低漏檢率使其在微生物檢測(cè)和分子分型診斷上有重要的地位和應(yīng)用前景[6]。

2018年從福建省兩個(gè)監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)中分離出20株單克隆陽性菌株,檢出率為6.67%,與近年來我省DEC檢出率相持平[7,8],張彥春等對(duì)北京順義區(qū)201 3-2016年腹瀉病例中DEC的檢測(cè),分離率為7.91%,以ETEC為主[9]；劉文娟對(duì)山東煙臺(tái)市2014-20 17年腹瀉病患者中致瀉性大腸埃希菌的檢測(cè)，檢出率9.32%,以EAEC為主[10]。我省近年來以 EAEC為優(yōu)勢(shì)種群,其次是 aEPEC,其中原因與EAEC的檢出率相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道astA毒力基因可在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，不僅存在于 EAEC菌中，也存在于EPEC、ETEC等其他致病性大腸埃希氏菌中，當(dāng)與其他毒力基因同時(shí)檢出，astA基因不作為型別判定依據(jù)[11,12]，也有同行[13]認(rèn)為僅檢出astA基因時(shí)可判定為EAE C。雖然astA的判定仍存在爭議，在本次實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)購買的PCR試劑盒使用說明書，將僅astA毒力陽性菌株暫時(shí)判定為EAEC,在本文中相較于aggR，pic，astA基因均陽性的典型EAEC,把僅astA陽性歸為非典型的EAEC，有利于進(jìn)一步檢測(cè)其他相關(guān)基因。過去采用普通PCR分離出ast基因條帶位置與引物二聚體的位置十分接近而被誤判漏檢,現(xiàn)采用熒光PCR對(duì)ast基因直接判定，提高EAEC的檢出率?？倷z出率相對(duì)其他某些省份偏低，可能原因是監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)樣本采集大多來自醫(yī)院和衛(wèi)生院，病人就診前已服用藥物。另外與當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)，環(huán)境衛(wèi)生條件、飲食習(xí)慣相關(guān)。

本文研究數(shù)據(jù)顯示，DEC具有明顯的季節(jié)性流行特征，6-9月份為檢出高峰，5歲以下兒童和60歲以上老人為DEC的易感人群，與腸道腹瀉病傳染的流行規(guī)律相吻合。DEC在5歲以下兒童急性腸道感染的病原中占有重要地位。主要引起腸炎、出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒癥綜合征等[12]，故應(yīng)加強(qiáng)對(duì)易感人群的預(yù)防工作，做好相關(guān)疾病防控。

藥敏結(jié)果顯示DEC對(duì)青霉素類、磺胺類及三代頭孢菌素類等藥物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥率，對(duì)碳青霉烯類、氨基糖苷類藥物敏感。與往年福建省數(shù)據(jù)相比較耐藥模式差別不大,但多重耐藥菌明顯增多[14]。產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌是由質(zhì)粒介導(dǎo)，使耐藥基因在細(xì)菌之間傳遞造成耐藥菌株的流行[15]，隨著廣譜抗菌藥物廣泛應(yīng)用,致瀉性大腸桿菌的多重耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，在臨床上要加大重視，加強(qiáng)病原學(xué)與耐藥的監(jiān)測(cè)，為臨床合理用藥提供依據(jù)，減少耐藥菌的產(chǎn)生與播散。