高磊，王鵬，陳中祥，吳松,3，湯施展，孫承宇，黃麗,4，覃東立*

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070; 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141;3. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030; 4. 東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150006)

隨著中國養(yǎng)殖行業(yè)的迅速發(fā)展，獸藥抗生素的使用量也在日益增加[1]。其中，磺胺類藥物(sulfanilamide, SAs)是人工最早合成的抗生素之一，具有價(jià)格低廉、抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定等諸多優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于人工養(yǎng)殖和臨床治療，已成為目前使用量較大的抗生素[2]。但SAs卻難以被生物吸收和代謝，具有難降解的特點(diǎn)[3]。據(jù)研究，有一半以上的SAs原藥及其代謝產(chǎn)物會(huì)隨生物糞便和尿液排出體外，通過淋溶、滲透等方式進(jìn)入生態(tài)環(huán)境中，對土壤、地表水及地下水造成抗生素污染[4-5]。SAs在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，對水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細(xì)菌性豎鱗病、爛鰓病及鞭毛蟲病等有良好的防治效果[6]。但其會(huì)隨食物鏈不斷富集，對人體造成致畸、致突變和致癌等危害[7-8]。因此，快速檢測漁業(yè)水環(huán)境中磺胺類藥物的殘留研究是十分必要的。

水環(huán)境中抗生素殘留檢測的常見方法為儀器檢測法，如高效液相色譜(HPLC)法[9-14]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[15-17]等。HPLC法僅能通過保留時(shí)間對目標(biāo)化合物進(jìn)行定性，當(dāng)基質(zhì)復(fù)雜導(dǎo)致待測目標(biāo)化合物與雜質(zhì)一同流出時(shí)，無法對其準(zhǔn)確定性定量。而LC-MS/MS法的檢測限更低，可以滿足水環(huán)境中痕量抗生素殘留檢測的要求，并且有更高的準(zhǔn)確度和更好的靈敏度，現(xiàn)已成為多組分分析的主流檢測方法，但前處理手段卻是制約該法檢測的瓶頸。

固相萃取(SPE)因具有良好的富集能力而被應(yīng)用于不同的前處理過程中[18]，且已經(jīng)被應(yīng)用于水樣品中SAs的檢測[19-20]，但由于商業(yè)化固相萃取小柱的價(jià)格較為昂貴，影響了其應(yīng)用范圍。磁性固相萃取(magnetic SPE，MSPE)是一種以磁性材料作為吸附載體的固相萃取技術(shù)，其主要原理是將磁性吸附劑直接加到待測樣品溶液中，通過振蕩吸附使得吸附劑和待測物充分接觸混勻，達(dá)到動(dòng)態(tài)吸附解析平衡，然后再通過外加磁場的作用將目標(biāo)物從樣品基質(zhì)中迅速分離出來，進(jìn)行洗脫等步驟。以磁性材料為萃取劑的MSPE技術(shù)具有萃取高效、步驟簡單及可批量處理等特點(diǎn)，已成為當(dāng)前材料、環(huán)境等多個(gè)學(xué)科的研究熱點(diǎn)。且MSPE法直接將萃取劑分散到水樣品中，解決了傳統(tǒng)的SPE過程中常出現(xiàn)的柱堵塞難題。此外，MSPE吸附劑易于擴(kuò)散，短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到吸附動(dòng)態(tài)平衡[21-22]，已成功應(yīng)用于水體中四環(huán)類[23]、除草劑[24]等多類物質(zhì)的分析檢測。

為能夠快速、準(zhǔn)確檢測養(yǎng)殖水體中SAs殘留情況，本研究選用碳納米管作為載體，使用制備的磁性碳納米管(MCNTs)作為漁業(yè)水環(huán)境中磺胺類抗生素的吸附劑，結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了漁業(yè)水環(huán)境中多種磺胺類抗生素的分離分析方法，以期豐富水體中SAs殘留檢測方法，為開展相關(guān)調(diào)查研究提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀(ACQUITY UPLC H-Class & XEVO TQ-S，美國沃特世公司)，配有ESI離子源；氮?dú)獍l(fā)生器(美國畢克公司)；超聲波清洗機(jī)(KQ-700E，昆山超聲儀器有限公司)；氮吹儀(N-EVAPTM111，美國Organomation公司)；渦旋混勻器(德國IKA公司)；純水器(美國Millipore公司)；水浴鍋，烘箱等。碳納米管(CNTs)、甲醇、乙腈、乙醇、甲酸、氯化鐵、氯化亞鐵及氨水等試劑耗材均購置于上海安譜實(shí)驗(yàn)室。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

磺胺噻唑(ST，99.1%)、磺胺嘧啶(SDZ，99.0%)、磺胺甲基嘧啶(SM1，99.2%)、磺胺二甲基嘧啶(SM2，99.6%)、磺胺甲基異噁唑(SMZ，99.0%)、磺胺多辛(SO，99.14%)、磺胺異噁唑(SFZ，98.7%)、磺胺喹噁啉(SOX，98.0%)、磺胺間甲氧嘧啶(SMX，95.0%)、磺胺間二甲氧嘧啶(SDM，99.0%)、磺胺氯噠嗪(SCP，100.0%)及磺胺甲噻二唑(SMZO，99.3%)抗生素標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司。準(zhǔn)確稱取一定量各抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解，定容于100 mL容量瓶中，配制成100 mg/L的SAs單標(biāo)及混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，-18 ℃保存。儲(chǔ)備液用乙腈稀釋，配制成各濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4 ℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 磁性碳納米管的制備

MCNTs制備參照課題組前期建立方法[25]，并做適當(dāng)修改。用3 mol/L的HNO3純化CNTs，加熱回流6 h，而后經(jīng)超純水清洗，離心洗滌多次，干燥研磨備用。隨后取2.0 g活化后的CNTs，加入到250 mL的三口瓶中，用100 mL的超純水沖洗瓶壁，隨后加入17.4 mmol的FeCl3·6H2O及8.7 mmol FeCl2·4H2O，超聲30 min。然后水浴加熱三口瓶，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃后，加入10 mL的氨水溶液，繼續(xù)反應(yīng)60 min。待反應(yīng)結(jié)束后，用超純水沖洗多次(至中性)，無水乙醇沖洗2次，置于60 ℃烘箱中干燥，備用。

1.4 樣品前處理

量筒取100.0 mL水樣品置于250 mL燒杯中，采用濾紙進(jìn)行過濾，濾液收集至另一250 mL燒杯中。加入30 mg制備好的MCNTs。用冰醋酸或氨水調(diào)節(jié)pH到7[26]，振蕩吸附20 min。萃取完成后，用超強(qiáng)磁鐵吸附MCNTs，小心傾倒上層水樣，然后采用1 mL 甲醇×3次(共計(jì)3 mL甲醇)渦旋超聲洗脫，每次30 s，收集洗脫液，洗脫液于40 ℃下氮?dú)獯到?，移液器吸取液相色譜初始流動(dòng)相將殘?jiān)ㄈ葜? mL，渦旋30 s，用2.5 mL注射器將定溶液過0.22 μm有機(jī)相過濾膜，最后采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，用Masslynx分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.5 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×50.0 mm色譜柱，柱溫為30 ℃，流速為0.3 mL/min。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，洗脫梯度程序?yàn)椋?～2.0 min，95%A；2.0～4.2 min，95%～5%A；4.2～6.4 min，5%A；6.4～6.5 min，5%～95%A；6.5～8.0 min，95%A。

質(zhì)譜條件：離子源，電噴霧離子源(ESI+)；毛細(xì)管電壓，3.0 kV；偏轉(zhuǎn)電壓，30 V；離子源溫度，150 ℃；去溶劑溫度，450 ℃；去溶劑氣流量，800 L/Hr；錐孔氣，250 L/Hr；錐孔電壓，20 V；碰撞氣流量，0.14 mL/min；選擇多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；磺胺類抗生素的反應(yīng)監(jiān)測模式的各參數(shù)如表1所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)塔板理論，研究采用了粒徑1.7 μm超高效液相色譜柱，相比于傳統(tǒng)的HPLC可得到更尖銳的峰形，同時(shí)還采用了更短的色譜柱(5 mm)可以在短時(shí)間內(nèi)完成多組分的分離。根據(jù)歐盟對化合物的要求，一般選取兩對特征離子對定性，其中的一對作為定量離子對。參照文獻(xiàn)[27-28]方法，對12種磺胺類抗生素的MRM質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。配置每種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品單標(biāo)，采用質(zhì)譜的混合模式在MS1全掃描模式下，得到待測物的母離子質(zhì)核比。隨后在MS2模式下以0～100 V不同的碰撞能量掃描化合物的兩個(gè)子離子，根據(jù)其豐度變化，得到最高響應(yīng)值下的子離子質(zhì)核比及碰撞能量參數(shù)，優(yōu)化參數(shù)結(jié)果如表1所示。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測模式下12種磺胺類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectral parameters for SAs in MRM

注：“*”示定量離子對。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 MCNTs添加水平對回收率的影響

MCNTs的添加水平是影響萃取效率其最終回收率關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)分別選用10、20、30、40及50 mg磁性材料加入到100 mL水樣中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其最終回收率如圖1A所示。由圖1A可以看出，MCNTs添加量為10 ～30 mg時(shí)，隨著添加量的增加12種磺胺類抗生素回收率逐漸升高；當(dāng)添加量超過30 mg后，抗生素回收率基本不變。因此，確定最優(yōu)條件為向100 mL水樣中添加30 mg MCNTs。

2.2.2 萃取時(shí)間的選擇

在磁性固相萃取中，萃取時(shí)間是影響萃取效果的關(guān)鍵因素，在保證可得到滿意的回收率的情況下，選擇較短的萃取時(shí)間會(huì)提高分析效率。本實(shí)驗(yàn)分別考察了5、10、20、30及40 min萃取對回收率的影響。由圖1B可以看出，當(dāng)萃取時(shí)間在5 ～20 min時(shí)，吸附效果逐漸變好，回收率逐步提高；當(dāng)超過20 min后，回收率基本保持不變，說明已達(dá)到萃取飽和狀態(tài)。故選取20 min作為最優(yōu)萃取時(shí)間。

圖1 萃取劑添加量(A)及萃取時(shí)間(B)對磺胺回收率的影響
Fig.1 Effects of different amounts of MCNTs (A) and extraction time (B) on recoveries

2.2.3 洗脫劑的選擇

萃取結(jié)束后，需選擇合適的洗脫劑將目標(biāo)抗生素洗脫下來。本實(shí)驗(yàn)選取了丙酮、甲醇和乙腈3種洗脫溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇可以很好地將磺胺類抗生素洗脫下來，并且價(jià)格具有一定優(yōu)勢。另外，洗脫體積影響后續(xù)氮?dú)獯蹈蓵r(shí)所用的時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)依次選用了1、3及5 mL作為洗脫體積進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)洗脫劑為1 mL×3次(每次超聲30 s)時(shí)回收率就可以達(dá)到80%以上。因此洗脫劑選用甲醇，每次1 mL，洗脫3次。

2.3 方法線性范圍及檢出限

分別配置20.00、50.00、100.00、200.00、500.00和1 000.00 ng/L濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mL，按照1.4處理后，采用優(yōu)化后的最佳條件對其進(jìn)行前處理，再經(jīng)進(jìn)行UPLC-MS/MS分析測定。結(jié)果表明，質(zhì)量濃度在20.00～1 000.00 ng/L范圍內(nèi)線性良好，其相關(guān)系數(shù)r大于0.995，檢出限為10.00 ng/L。

選取低濃度(10.00 ng/L)、中濃度(100.00 ng/L)和高濃度(1 000.00 ng/L)3個(gè)濃度梯度進(jìn)行質(zhì)控樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，以純凈水的加標(biāo)回收率進(jìn)行校正，測定加標(biāo)回收率，發(fā)現(xiàn)方法回收率均在78.06%～97.86%。日內(nèi)精密度在1.15%～8.79%，日間精密度在2.13%～9.59%(表2)。

表2 磺胺類抗生素(12種)的加標(biāo)回收率Tab.2 Recoveries and precision for the SAs in fishery water

2.4 實(shí)際樣品分析

選取4個(gè)哈爾濱周邊養(yǎng)殖池塘(各1個(gè)樣品)、哈爾濱道里區(qū)室內(nèi)自來水(1個(gè)樣品)和某品牌瓶裝礦泉水(1個(gè)樣品)，共計(jì)6個(gè)實(shí)際樣品。在優(yōu)化后的最佳條件下進(jìn)行前處理并檢測，發(fā)現(xiàn)哈爾濱一處池塘有磺胺二甲基嘧啶(SM2)殘留。經(jīng)計(jì)算，該樣品中SM2含量為42.40 ng/L，總離子流圖如圖2C所示?？瞻讟悠泛图訕?biāo)樣品的總離子流圖見圖2A和圖2B。

圖2 總離子流圖與池塘水中SM2殘留色譜圖
A：空白樣品；B：標(biāo)準(zhǔn)樣品(250.0 ng·L-1)；C：實(shí)際樣品(其中箭頭指示部分為SM2兩個(gè)離子對的放大色譜圖)。
Fig.2 The total ion chromatogram of the blank sample (A); the standard SAs (B); and the real sample (C)
The arrow indicates the extracted ion chromatograms of SM2.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了MSPE-UPLC-MS/MS法測定漁業(yè)水環(huán)境中磺胺類抗生素殘留的高效分析方法，所分析的磺胺類抗生素在20.00～1 000.00 ng/L表現(xiàn)出較好的線性，相關(guān)系數(shù)全部大于0.995。在不同加標(biāo)濃度下，12種抗生素回收率都在78.06%～97.86%范圍內(nèi)，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于9.59%。該方法具有較為廣泛的線性范圍，并且可以一次振蕩多組樣品，適用于大批量樣品檢測，MSPE用時(shí)較少(約為 25 min)，且具有有機(jī)試劑消耗少、環(huán)保安全及重現(xiàn)性佳等特點(diǎn)，因此能夠應(yīng)用于實(shí)際漁業(yè)水環(huán)境樣品的檢測、監(jiān)測中，具有很好的應(yīng)用前景。