吳嫚，李龍云，裴文鋒，Zhang Jinfa，于霽雯*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國家重點實驗室鄭州大學(xué)研究基地，河南安陽455000；2.Department of Plant and Environmental Science,New Mexico State University,Las Cruces,NM 88003,USA）

棉花是我國重要的經(jīng)濟作物，棉纖維是重要的天然植物纖維[1]。 馬克隆值是衡量棉纖維品質(zhì)的重要指標之一，它綜合反映了纖維的粗細程度和成熟度， 三者與棉紡工藝設(shè)備的清雜效率、棉紗外觀品質(zhì)、棉紗強力和可紡性有密切關(guān)系[1-3]。因此，合理的原棉馬克隆值是提高紡紗質(zhì)量的基礎(chǔ)[4]。因此，從分子水平篩選并鑒定調(diào)控棉纖維發(fā)育的關(guān)鍵因子，對棉花品質(zhì)分子育種和解析棉纖維發(fā)育的分子機制具有重要的理論價值。

棉纖維細胞由胚珠外珠被單個細胞分化而來，是高等植物中伸長最快、合成纖維素最多的模式單細胞[5]。 其分化和發(fā)育過程可分為4 個時期：纖維發(fā)育的起始期、伸長期、次生壁增厚期和成熟期。 棉纖維細度、成熟度和馬克隆值主要受纖維次生壁形成特性的影響。 棉纖維細胞的次生壁增厚是1 個復(fù)雜的生理過程，涉及細胞壁的松弛，液泡膨壓的反作用力，膜脂、細胞壁成分和相關(guān)蛋白的生物合成及運輸過程，受到許多基因的表達調(diào)控[6-8]。 迄今，已有一些相關(guān)的遺傳和數(shù)量性狀位點（Quantitative trait locus,QTL）定位的報導(dǎo)[9-16]。 Yu 等[17]以陸地棉 SG747 和海島棉 Giza75為親本，構(gòu)建回交近交系BIL 群體，在5 個環(huán)境下檢測到8 個馬克隆值QTLs， 解釋表型變異7.16%～17.57%，分布于 1、9、12、14、16、18、19 和24 號染色體。徐鵬等[18]以二倍體棉花Gossypium klotzschianumL.為供體親本，以陸地棉Simian2為輪回親本， 構(gòu)建染色體片段代換系BC2F4群體， 檢測到2 個與馬克隆值相關(guān)的穩(wěn)定的QTLqFMIC-7-1 和qFMIC-7-2， 最高解釋9.0%表型變異率。 Shang 等[19]以 GX1135 和 GX100-2g 為親本構(gòu)建了 1 個 RIL 群體， 檢測到 4 個馬克隆值QTLs，其中qFM-chr19-1 在多個環(huán)境下被檢測到。但目前利用QTLs精細定位方法獲得的棉纖維發(fā)育相關(guān)基因還比較少。 基因芯片是大規(guī)模分析基因表達譜的有效手段之一， 它能夠同時檢測幾萬個基因的轉(zhuǎn)錄水平， 由此可以檢測不同條件下差異表達的基因，了解這些基因的表達調(diào)控和功能[20-23]。近年來， 美國Affymetrix 的棉花基因組芯片已被廣泛應(yīng)用于棉花基因表達譜的分析[24-31]。Gilbert 等[32]利用Affymetrix 公司的棉花寡聚核苷酸芯片對2個Li2近等基因系Li2Li2和li2li2的纖維 （3、12 和16 DPA）進行了基因富集和代謝途徑分析，發(fā)現(xiàn)乙烯生物合成和初生細胞壁合成過程參與了棉纖維的發(fā)育過程。 Wu 等[33]利用 Affymetrix 公司的棉花基因芯片對棉花皮棉產(chǎn)量存在顯著差異的兩組回交近交系進行分析， 并結(jié)合QTLs 共定位和SSCP 分析獲得了3 個與皮棉相關(guān)的SNP位點。 Wu 等[34]利用 Affymetrix 公司的棉花基因芯片對棉纖維長度性狀存在顯著差異的兩組回交近交系進行差異表達基因分析，并結(jié)合熒光定量PCR（Polymerase chain reaction）發(fā)現(xiàn)類動蛋白和過氧化物酶2 個基因與纖維發(fā)育存在密切關(guān)系。 Hande 等[35]利用 Affymetrix 公司的棉花基因芯片對棉花突變體Fl 和野生型0 DPA 和10 DPA進行分析發(fā)現(xiàn) AP2-EREBP、C2H2、C3H、HB 等參與了棉纖維細胞伸長過程。 雖然到目前為止，已經(jīng)利用基因芯片或者RNA-seq 等技術(shù)篩選獲得了大量與纖維發(fā)育相關(guān)的基因，但利用2 個馬克隆值存在顯著差異的回交近交系研究棉纖維發(fā)育相關(guān)基因目前還比較少。

本研究選用馬克隆值差異較大的2 個回交近交系NMGA-140 和NMGA-051， 利用基因芯片比較兩者間開花后10 DPA 發(fā)育纖維中的轉(zhuǎn)錄表達譜，旨在篩選和鑒定棉纖維發(fā)育相關(guān)的差異表達基因，為棉纖維發(fā)育關(guān)鍵候選基因的克隆和功能驗證提供豐富的基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗地點

試驗地點位于河南省安陽縣白璧鎮(zhèn)中棉所試驗基地進行（36o06'N，114o21'E），室內(nèi)試驗在安陽市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花生物學(xué)重點實驗室進行。

1.2 試驗材料

海陸高世代回交自交系（Backcross introgression line,BIL）群體引自 Yu 等[17]。 利用 SAS 軟件對海陸高世代BILs 群體2006―2008 年纖維品質(zhì)數(shù)據(jù)進行Duncan Grouping 顯著性分析， 從中選擇馬克隆值最大的材料NMGA-140 （馬克隆值：6.2）和馬克隆值最小的材料NMGA-051（馬克隆值：4.0）。 開花當天對棉鈴進行掛牌標記，選取 5、10、15、20、25 DPA 棉鈴，剝?nèi)±w維后迅速浸入液氮速凍，保存在－80℃冰箱中備用。 同時采集了葉、花瓣和蕾，處理方法同上。 每個樣品取3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3 試驗方法

1.3.1RNA 提取和質(zhì)量檢測。利用改良的CTAB法提取棉纖維樣品（5、10、15、20 和 25 DPA）及不同組織部位（葉、花、蕾）的總 RNA[36]。 每個樣品 3個生物學(xué)重復(fù)分開提取RNA。 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA 的 28S 和 18S rRNA 比例，以評估總RNA 的完整性及純度。 利用DU800 核酸 / 蛋白質(zhì)分析儀 （Beckman Coulter，Brea，CA，USA）檢測RNA 的質(zhì)量和濃度。

1.3.2基因芯片的制備及差異表達基因的篩選。GeneChip○R棉花基因組芯片購自美國 Affymetrix公司，基因芯片雜交及分析由上海晶泰生物技術(shù)有限公司完成。 每個樣品3 個生物學(xué)重復(fù)混合成1 個RNA 池，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 與芯片雜交，用高分辨率掃描儀GeneChip Scanner 3000 對染色后的芯片進行掃描。 然后利用GeneChip Operating Software （GCOS），使用 MAS5 方法進行數(shù)據(jù)均一化，綜合考慮PM 和MM 探針的信號值來判定基因的表達情況和變化情況[29]。

1.3.3差異表達基因的功能預(yù)測。利用COG 庫（Clusters of orthologous groups）和 COGNITOR程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）對篩選出的差異表達基因進行功能預(yù)測分析。

1.3.4qRT-PCR。利用 AMV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 合成cDNA（普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司）。 從差異表達基因中隨機挑選2 個上調(diào)基因和2 個下調(diào)基因， 使用Oligo 軟件設(shè)計引物 （表1），以看家基因18S rRNA 為內(nèi)參對照，利用Go-Taq qPCR Master Mix（普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司） 在熒光定量PCR 儀Roche Light Cycler 480（Roche 公司）進行 qRT-PCR 分析。 引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。 數(shù)據(jù)分析采用雙標準曲線法分析2 個材料間的相對表達量：F＝（樣品1 目的基因濃度/ 樣品 1 看家基因濃度）/（樣品2 目的基因濃度/ 樣品2 看家基因濃度）。 每個樣品qRT-PCR 設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)。

表1 實時熒光定量PCR 所用基因及其引物序列Table1 Gene Primers for quantitative RT-PCR analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 田間數(shù)據(jù)分析結(jié)果

對NMGA-140 與NMGA-051 的纖維長度、馬克隆值、斷裂比強度、伸長率、整齊度指數(shù)的平均值進行t測驗，檢驗材料間差異的顯著性。纖維品質(zhì)包括2006 年安陽4 個點和 2007 年安陽2個點共6 個點的數(shù)據(jù)。 根據(jù)雙尾t測驗的結(jié)果，NMGA-140 與 NMGA-051 的纖維長度、馬克隆值、斷裂比強度、整齊度指數(shù)都達到差異顯著水平，其中纖維長度和馬克隆值達到了極顯著水平（表2）。 這說明以馬克隆值存在顯著差異的NMGA-140 與NMGA-051 篩選到的差異表達基因在纖維發(fā)育過程中對纖維長度和纖維強度性狀可能也存在潛在的影響。

表2 NMGA-140 和NMGA-051 纖維品質(zhì)性狀差異Table 2 Fiber quality traits difference between NMGA-140 and NMGA-051

2.2 基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性驗證

本研究參考李龍云等[29]對基因芯片數(shù)據(jù)的質(zhì)控評估驗證方法。 從NMGA-140 與NMGA-051芯片雜交實驗質(zhì)控評估結(jié)果來看，各項芯片實驗參數(shù)滿足Affymetrix 質(zhì)量控制標準。 其一，芯片平均雜交背景信號值低于50，滿足不大于100 的標準；其二，芯片上不存在大于芯片面積2.5%的痕跡；其三，RPT 文件（.rpt）所列的芯片上的內(nèi)參基因中至少有1 個基因， 其3'端的探針集合的雜交信號不超過其5'端探針集合的雜交信號的3 倍。

2.3 差異表達基因分析

從圖1 中可以看出 NMGA-140 與 NMGA-051 中基因表達量的比例信息和信號強度的關(guān)系。在基因表達譜的散點圖上，每1 個點表示1個基因。 散點圖中共有8 條斜線，平行對稱分布著 2 倍、3 倍、10 倍、30 倍 Fold change lines，它們由 上 至 下 分 別 為 30、10、3、2、－2、－3、－10和－30。 圖1 結(jié)果顯示基因表達譜中基因分布較為分散，2 和－2 線外存在大量的信號信息（NMGA-051 和 NMGA-140 信號比值為±2），表明通過分析比較2 張芯片得到了大量的差異表達基因。 棉花基因組芯片共有24 029 個探針組成，從表2 中可以看到NMGA-140 中有13 198 個探針信號檢測到（55%），NMGA-051 中有 13 736 個探針信號檢測到（57%）。NMGA-051（馬克隆值4.0）比NMGA-140（馬克隆值6.2）檢測到了更多的探針信號。 根據(jù) ratio＞2.0 和 ratio＜0.5 的標準，通過分析比較NMGA-140 和NMGA-051 共篩選得到2 655 個差異表達基因， 其中1 765 個基因在NMGA-140 中高表達， 而 890 個基因在 NM-GA-051 中高表達。

圖1 NMGA-140 與NMGA-051 基因芯片雜交信號散點圖Fig.1 Scatter Graph of NMGA-140 and NMGA-051

表2 芯片雜交結(jié)果Table 2 Results of Single Array Analysis

2.4 差異表達基因的功能預(yù)測

利用COG 數(shù)據(jù)庫對在NMGA-140 和 NMGA-051 的差異表達的2 655 個基因進行了功能分類，根據(jù)所參與的代謝過程分為23 類（圖2）。這些差異表達的基因中功能預(yù)測基因（15.57%）和翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成相關(guān)基因（13.54%），翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、分子伴侶相關(guān)基因（9.31%）是3 個主要的分類。 在這些基因中根據(jù)P值和Signal Log2Ratio 以及前人的研究結(jié)果挑選了24 個可能在纖維發(fā)育過程中起到重要作用的基因。

2.5 差異表達基因的實時熒光定量PCR 檢測

為了進一步通過實時熒光定量PCR 驗證芯片數(shù)據(jù)的可靠性， 隨機挑選了4 個差異表達顯著的基因（ΔP＜0.001；Log2ratio＞1.5 即差異表達倍數(shù)大于3）進行實時熒光定量PCR 的檢測（2 個上調(diào)基因，2 個下調(diào)基因）（表 4）。

圖2 差異表達基因的功能分類Fig.2 Functional groups of the Significantly differentially expressed genes

表3 基因芯片中差異表達倍數(shù)高以及與細度發(fā)育相關(guān)的基因Table 3 Significantly and fiber micronaire-related differentially expressed genes

從圖 3 中可以看出，β-tub1 基因在 NMGA-140 和 NMGA-051 的纖維、葉、花和蕾中的表達趨勢基本相同，都是在纖維中的表達量最高，在蕾中的表達量最低，由此可見β-tub1是纖維特異表達基因， 推測可能與纖維發(fā)育相關(guān) （圖3A）。β-tub10基因在馬克隆值較小的材料NMGA-051纖維中的表達量是最高的， 且顯著高于馬克隆值較大的材料NMGA-140（圖3B）。從圖3 中可以看出， 通過在NMGA-140 和NMGA-051 中不同組織中分析TUA7 基因的表達量， 發(fā)現(xiàn)TUA7基因不是纖維特異表達基因 （圖 3C）。Ghi.3578.1.S1_s_at是一個差異表達倍數(shù)較高的未知功能基因 （Log2 ratio=4.8）， 其在馬克隆值較大的材料NMGA-140 蕾中表達量最高， 在馬克隆值較小的材料NMGA-051 中在纖維中表達量最高 （圖3D）。

從圖 4 中可以看出，β-tub1基因在 NMGA-140 和NMGA-051 中5 DPA 時的表達量均極低，后上升至到10 DPA。 在馬克隆值較小的材料NMGA-051 中，其繼續(xù)上升，至15 DPA 達到最高點，至20 DPA 時持續(xù)下降；而在馬克隆值較大的材料NMGA-140 中，15 DPA 時下降到最低值，后急速上升，20 DPA 達到最高值，然后到25 DPA 持續(xù)下降。兩個材料在纖維發(fā)育10、15、20 DPA 時達到差異極顯著水平 （圖 4A）。β-tub10基因在NMGA-051 中，5 DPA 時表達量開始上升，10 DPA 時達到最高點， 后至20 DPA 持續(xù)下降，到 25 DPA 時又有所回升； 在 NMGA-140 中，β-tub10基因表達量開始時上升，而后直至15 DPA持續(xù)下降，后持續(xù)上升，25 DPA 時達到最大值。 2個材料在纖維發(fā)育 10、15、20、25 DPA 時達到極顯著差異水平（圖 4B）。 由此可見，β-tub10基因與棉纖維發(fā)育密切相關(guān)。 對TUA7 基因進行不同纖維發(fā)育時期表達量分析發(fā)現(xiàn)在NMGA-051 中，5 DPA 的表達量最高，10―25 DPA 表達量逐漸下降； 在 NMGA-140 中，5―15 DPA 表達量逐漸上升，到15DPA 時達到最高，而25 DPA 持續(xù)下降。2 個材料 10、20 DPA 達到了顯著差異水平 （圖4C）。 不同發(fā)育時期表達量分析發(fā)現(xiàn)Ghi.3578.1.S1_s_at基因 在 NMGA-140 和 NMGA-051 中均在 5 DPA 表達量最高， 10―25 DPA 在 NMGA-051 和 NMGA-140 中表達量逐漸下降 （圖4D）。

通過對β-tub1、β-tub10、TUA7和未知功能基因Ghi.3578.1.S1_s_at4 個差異表達基因進行不同組織部位和不同發(fā)育時期的實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，β-tub1、β-tub10基因和Ghi.3578.1.S1_s_at可能參與了棉纖維發(fā)育過程， 有待進一步進行功能驗證。同時，分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)基因芯片和實時定量PCR 的檢測結(jié)果一致，說明芯片數(shù)據(jù)具有生物學(xué)意義上的可重復(fù)性，結(jié)果可靠。

表4 基因芯片中與纖維發(fā)育相關(guān)差異表達明顯的基因Table 4 Significantly and fiber-related differentially expressed genes for qRT- PCR

3 討論

馬克隆值是評價棉花纖維品質(zhì)好壞的指標之一，直接影響棉纖維的加工和最終產(chǎn)品的質(zhì)量。細纖維可使更多的纖維紡入紗線，從而使紗線更強，紡織時間更短。因此，棉纖維細度性狀的改良已經(jīng)成為當前棉花纖維品質(zhì)遺傳改良工作的研究熱點。本研究在已有的回交近交系（BIL）群體中選取馬克隆值最大的材料NMGA-140 （馬克隆值6.2）和馬克隆值最小的材料NMGA-051 （馬克隆值4.0）， 利用Affymetrix 基因芯片技術(shù)分析比較了NMGA-140 和NMGA-051 的基因表達譜，通過實時 熒 光 定 量 PCR 對Ghi.3578.1.S1_s_at、TUA7、β-tub1、β-tub10進行了不同組織部位和不同發(fā)育時期表達量分析， 為以后纖維發(fā)育相關(guān)基因克隆及功能驗證提供了重要參考。

圖3 4 個基因在不同組織器官中的實時熒光定量PCR 結(jié)果Fig.3 qRT-PCR results of four genes in different tissues

圖4 4 個基因在棉纖維不同發(fā)育時期的實時熒光定量PCR 結(jié)果Fig.4 qRT-PCR results of four genes in fiber development

芯片雜交試驗的可靠性驗證是利用芯片開展相關(guān)研究工作的重要環(huán)節(jié)之一。 本研究從基因芯片數(shù)據(jù)的質(zhì)控評估和差異表達基因的實時熒光定量PCR 檢測2 個方面驗證了芯片結(jié)果的可靠性。從NMGA-140 與NMGA-051 芯片雜交實驗的平均雜交背景信號、內(nèi)參基因等質(zhì)控評估結(jié)果來看，各項芯片實驗參數(shù)滿足Affymetrix 質(zhì)量控制標準。 從Ghi.3578.1.S1_s_at，TUA7，β-tub1，β-tub104 個差異表達基因纖維發(fā)育10 DPA 實時熒光定量 PCR 結(jié)果來看，β-tub1和TUA7在 NMGA-140中的表達量顯著高于NMGA-051，說明β-tub1和TUA7基因的表達量越高， 纖維馬克隆值越大；β-tub10和Ghi.3578.1.S1_s_at在 NMGA-051 中的表達量高于NMGA-140， 說明β-tub10和Ghi.3578.1.S1_s_at的表達量越高， 纖維馬克隆值越小。以上與基因芯片雜交試驗檢測結(jié)果一致，說明本研究芯片數(shù)據(jù)具有生物學(xué)意義上的可重復(fù)性，結(jié)果可靠。

微管(microtubule)是真核細胞中幾種主要的細胞質(zhì)骨架纖絲之一， 它的主要結(jié)構(gòu)成分是微管蛋白 (tubulin)， 在纖維發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。 在棉纖維細胞中， 迄今己經(jīng)識別出了9 種α-tubulin和 7 種β-tubulin蛋白[37]。 Li 等[38]克隆了1 個β-tubulin基因GhTUB1， 在纖維發(fā)育快速伸長期 8DPA 優(yōu)勢表達； 而另 1 個β-tubulin基因Gh-BTubL在酵母中過量表達可以使酵母縱向伸長 1.7 倍多[38]。 劉迪秋等[39]通過分析 20 DPA 棉纖維構(gòu)建的SSH 文庫發(fā)現(xiàn)了 3 個β-tubulins， 并認為在20DPA 以后優(yōu)勢表達的β-tubulins可能特異地調(diào)控棉纖維的纖維素沉積[39]。 本研究利用基因芯片分析比較了馬克隆值存在顯著差異的兩個陸?；亟唤幌担?并獲得了兩個微管蛋白基因β-tub1和β-tub10基因。 通過對其進行不同組織部位和不同時期表達模式分析發(fā)現(xiàn)，β-tub1基因在 NMGA-140 和 NMGA-051 的纖維中優(yōu)勢表達， 且纖維發(fā)育10 DPA 時在馬克隆值較大的材料中表達量顯著高于馬克隆值較小的材料。 在纖維發(fā)育 10、20 和 25 DPA 時，β-tub1基因在馬克隆值較大的材料中表達量顯著高于馬克隆值較小的材料。 結(jié)果表明β-tub1基因可能在纖維發(fā)育過程中負向調(diào)節(jié)棉纖維發(fā)育。β-tub10基因在馬克隆值較小的材料NMGA-051 纖維中的表達量是最高的， 且顯著高于馬克隆值較大的材料NMGA-140。β-tub10基因在纖維發(fā)育早期 （5―15 DPA）在馬克隆值較小的材料中表達量顯著高于馬克隆值較大的材料，纖維發(fā)育后期（20―25 DPA）在馬克隆值較大的材料中的表達量顯著高于馬克隆值較小的材料。 結(jié)果表明β-tub10 基因可能在纖維發(fā)育快速伸長期正向調(diào)節(jié)棉纖維發(fā)育過程。 這與前人的研究結(jié)果相似[40]。Ghi.3578.1.S1_s_at是1 個未知功能基因，在馬克隆值較小的材料纖維中表達量都最高，在NMGA-140 和NMGA-051 中均在5DPA 時的表達量最高， 從10―25 DPA 在2 個材料中表達量逐漸下降，推測該基因可能在早期對纖維發(fā)育起到一定的作用。 對以上3 個基因有待于后續(xù)實驗的進一步進行功能驗證。

4 結(jié)論

本研究利用基因芯片分析比較了2 個馬克隆值存在顯著差異的陸?；亟唤幌?， 通過實時熒光定量PCR 技術(shù)對篩選到的4 個差異表達基因進行了表達模式分析， 得到了與棉纖維發(fā)育密切相關(guān)的基因， 為今后棉纖維發(fā)育基因克隆和功能驗證提供了豐富的基因資源， 也為棉纖維品質(zhì)分子育種打下了良好的基礎(chǔ)。