任巧玲，張家慶，陸東鋒，王璟，陳俊峰，馬強，白獻曉，郭紅霞，高彬文，邢寶松

研究報告

乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中l(wèi)incRNAs表達譜比較分析

任巧玲1，張家慶1，陸東鋒2，王璟1，陳俊峰1，馬強1，白獻曉1，郭紅霞1，高彬文1，邢寶松1

1. 河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，鄭州 450002 2. 河南花花牛實業(yè)總公司，鄭州 450000

初產(chǎn)母豬斷奶后能否正常發(fā)情對養(yǎng)豬生產(chǎn)影響重大，也是初產(chǎn)母豬被淘汰的主要原因。本研究以乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬為研究對象，首次利用RNA-seq技術(shù)對其下丘腦-垂體-卵巢軸中的基因間長鏈非編碼RNAs(long intergenic noncoding RNAs, lincRNAs)進行篩選比較，得到lincRNAs的表達圖譜，并對其特征和功能進行了初步分析。結(jié)果顯示，在乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中鑒定得到3519個lincRNAs，以發(fā)情組為對照共有17個lincRNAs存在差異表達，其中12個表達上調(diào)，5個表達下調(diào)(FC≥2,<0.05)。選擇4個差異表達的lincRNAs經(jīng)qRT-PCR驗證，其表達水平與測序結(jié)果基本一致。對這17個差異表達的lincRNAs進行GO分析、KEGG通路分析及l(fā)incRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)這些lincRNAs主要與豬卵母細胞減數(shù)分裂成熟、卵巢細胞分化及顆粒細胞凋亡等生殖活動相關(guān)。本研究結(jié)果豐富了豬lincRNAs數(shù)據(jù)資源，為進一步深入研究初產(chǎn)母豬的生殖機能提供了理論依據(jù)。

lincRNAs；乏情；發(fā)情；初產(chǎn)母豬；下丘腦–垂體–卵巢軸

初產(chǎn)母豬乏情或發(fā)情延遲已成為養(yǎng)豬生產(chǎn)中的一個常見難題。大長二元母豬作為當今瘦肉型商品豬生產(chǎn)的主要母本，其乏情問題對生產(chǎn)的影響重大。造成初產(chǎn)母豬乏情的主要原因有遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)和管理水平等因素，隨著規(guī)?；i場管理水平的提高及動物營養(yǎng)研究的深入，非遺傳因素已得到了很好的改善。近年來，一些學者從基因遺傳方面對母豬情期控制進行了一些有意義的探索。研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)情和乏情母豬的下丘腦–垂體–卵巢軸中許多生殖激素基因的表達發(fā)生了明顯的改變，如、、、、和等在乏情母豬體內(nèi)顯著下調(diào)，這些基因均與母豬的發(fā)情等生殖活動密切相關(guān)[1,2]。Kong等[2]報導在發(fā)情和乏情全同胞初產(chǎn)母豬的垂體和卵巢中均檢測到的表達量較高，且存在顯著差異(<0.01)，并證實了該基因通過調(diào)控卵泡細胞的發(fā)育平衡來最終調(diào)控斷奶后初產(chǎn)母的發(fā)情行為。另外，研究表明由編碼的NKB與其受體NK3R結(jié)合能夠促進GnRH的釋放進而誘導動物初情期的啟動,當發(fā)生突變時，導致低促性腺激素綜合癥的發(fā)生，動物初情期啟動失敗[3~5]。下丘腦–垂體–卵巢軸(hypothalamic- pituitary-ovarian axis, HPOA)是一個完整而協(xié)調(diào)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，它的每個環(huán)節(jié)均有其獨特的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，并且互相調(diào)節(jié)、互相影響，在哺乳動物的生殖活動中起著主要的調(diào)節(jié)作用，也是研究動物生殖問題的關(guān)鍵切入點。

lincRNA (long intergenic noncodingRNA, lincRNA)是一類由蛋白編碼基因間的非編碼序列轉(zhuǎn)錄且轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的功能性RNA分子[6]。隨著高通量RNA-seq技術(shù)的發(fā)展，不同物種中越來越多的lincRNAs被鑒定，至今在哺乳動物基因組中已發(fā)現(xiàn)3500多種lincRNAs，多項研究已經(jīng)證實一些lincRNAs在不同的生物過程中發(fā)揮著重要作用，如表觀遺傳調(diào)控[7]、多能性維持和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[8]、X染色體失活[9]及生殖調(diào)控[10,11]等。與mRNA相比，lincRNA的表達水平在組織間變化更大，許多l(xiāng)incRNAs優(yōu)先在大腦和睪丸組織中表達[6]。lincRNAs的組織特異性表達表明其具有發(fā)育和細胞類型特異性功能[12]。目前l(fā)incRNAs在初產(chǎn)母豬乏情和發(fā)情狀態(tài)下丘腦–垂體–卵巢軸中的表達及功能還鮮有報導。為了探索lincRNAs在初產(chǎn)母豬下丘腦-垂體-卵巢中的表達情況及對生殖活動的影響，本研究對乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中的lincRNAs進行全基因組篩選比較，并對其特征和功能進行了初步分析，為進一步深入研究初產(chǎn)母豬的生殖機能提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和樣品制備

試驗豬為體況和年齡基本一致的半同胞初產(chǎn)大長二元母豬，由河南鄢陵天鵬牧業(yè)有限公司提供。在同等條件下飼養(yǎng)在同一圈舍內(nèi)，每天用同一頭公豬試情1~2次，選取斷奶后7 d有明顯發(fā)情反應(yīng)的3頭視為正常發(fā)情母豬(發(fā)情組)，屠宰后分別取下丘腦、垂體和卵巢，用生理鹽水沖洗后，立即放入液氮中保存。選取公豬試情到21 d仍無任何發(fā)情反應(yīng)的3頭視為乏情母豬(乏情組)，屠宰后分別取下丘腦、垂體和卵巢，處理方法同發(fā)情母豬。

1.2 樣品總RNA提取

采用RNAiso Plus (日本TaKaRa公司)試劑盒分別提取乏情組3頭母豬和發(fā)情組3頭母豬的下丘腦、垂體和卵巢組織總RNA，用Nano-Drop ND-2000紫外分光光度計(美國Thermo Scientific公司)分析濃度，用Agilent BioAnalyzer 2100 (加拿大Agilent Tech-nologies公司)進行質(zhì)量檢測，所有樣品要求：260 nm/280 nm>2.1，RIN>8.0。分別取等量乏情和發(fā)情母豬的下丘腦、垂體、卵巢質(zhì)檢合格的RNA混合成6個樣品池。

1.3 cDNA文庫構(gòu)建和RNA-seq

分別從6個混池中取大約20 μg RNA，用帶有Oligo(dT)的磁珠(無錫百邁格生物科技有限公司)富集PolyA+RNA，并加入RNA斷裂試劑(美國Ambion公司)使之片段化。用六堿基隨機引物和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(上海生工生物工程股份有限公司)合成第一鏈cDNA，用DNA聚合酶Ⅰ、RNase H和dNTPs (上海生工生物工程股份有限公司)合成第二鏈cDNA。依照Illumina Hiseq2500測序平臺的要求，對構(gòu)建的6個cDNA文庫依次進行末端修復、3′末端加A、連接接頭后純化、PCR擴增富集、定量，質(zhì)檢符合要求后上機測序。測序工作由上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司完成。

1.4 序列比對和轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建

6個文庫測序獲得的Raw reads進行質(zhì)控處理獲得Clean reads，用Tophat (v2.0.14)軟件把每個樣本的Clean reads比對到豬參考基因組(11.1) (表1)。用Cufflinks (v2.2.1)把比對上的片段拼接成轉(zhuǎn)錄本(GTF格式)，把來自乏情組和發(fā)情組的6個Cufflinks拼接轉(zhuǎn)錄本用Cufflinks軟件包中的Cuffmerge融合成1個非冗余轉(zhuǎn)錄組，后續(xù)用這個非冗余轉(zhuǎn)錄組來鑒定novel lincRNAs。

表1 6個cDNA文庫測序質(zhì)量和比對信息統(tǒng)計分析

1.5 lincRNAs鑒定

乏情和發(fā)情母豬下丘腦、垂體、卵巢融合非冗余轉(zhuǎn)錄組中的lincRNAs通過以下步驟鑒定[13,14]： (1)用Cuffcompare把融合轉(zhuǎn)錄本與Ensembl數(shù)據(jù)庫中的已知注釋比對，去除可能的已知轉(zhuǎn)錄本；(2)過濾掉單外顯子和長度小于200 bp的轉(zhuǎn)錄本；(3)只挑選離Ensembl中注釋的豬的任何編碼基因或持家的非編基因至少500 bp遠的轉(zhuǎn)錄本；(4)分別用蛋白編碼潛力計算軟件CNCI和CPAT預測所篩選轉(zhuǎn)錄本的編碼潛力，二者取交集即為lincRNAs (圖1)。

1.6 差異表達的lincRNAs和差異表達的mRNAs篩選

利用DESeq軟件(http://bioconductor.org/packages/ release/bioc/html/DESeq.html)對各樣本的counts數(shù)目進行標準化處理(采用baseMean值來估算表達量)，計算差異倍數(shù)，并采用NB (負二項分布檢驗的方式)對reads數(shù)進行差異顯著性檢驗，篩選<0.05且Fold Change>2的為差異表達的lincRNAs和mRNAs。lincRNAs和mRNAs表達量計算用FPKM法，即每百萬片段中來自某一基因每千堿基長度的片段數(shù)目。

1.7 lincRNAs功能預測

對于差異表達的17個lincRNAs，計算每個lincRNA與蛋白編碼基因之間的Pearson相關(guān)系數(shù)，選取<0.05，||>0.8的基因，即為與之共表達的編碼基因。使用 DAVID軟件在線對共表達蛋白編碼基因進行功能富集和通路分析，用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，共表達基因顯著富集的GO條目和KEGG通路。

1.8 lincRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)分析

為了鑒定差異表達的lincRNAs和差異表達的mRNAs之間的相互作用，在lincRNAs和mRNAs進行Pearson相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上構(gòu)建了lincRNA- mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)。即先選取<0.05，||>0.8關(guān)系對，然后用Cytoscape軟件來構(gòu)建lincRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)。

圖1 豬lincRNAs鑒定流程

1.9 差異表達lincRNAs qRT-PCR驗證

分別選取2個表達上調(diào)和2個表達下調(diào)的lincRNAs進行qRT-PCR驗證(每個組織重復3次)。RNA為實驗室測序時提取凍存的RNA，即乏情母豬(3個下丘腦樣品、3個垂體樣品、3個卵巢樣品)和發(fā)情母豬(3個下丘腦樣品、3個垂體樣品、3個卵巢樣品)的總RNA。用RevertAid Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Scientific公司)合成cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM(日本TaKaRa公司)說明書進行qRT-PCR驗證。以為內(nèi)參基因，引物由武漢賽維爾生物科技有限公司設(shè)計、合成，引物序列見表2。用2–ΔΔCt法計算lincRNAs的相對表達量。檢驗對相對表達量進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為“平均數(shù)±標準差(Mean± SD)，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄本組裝及l(fā)incRNAs鑒定

為了鑒定乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中的lincRNAs，首先用Illumina Hiseq2500對乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬的下丘腦、垂體和卵巢組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序，去除接頭及低質(zhì)量序列后，平均每個樣本得到52,400,881條clean reads，平均有42,364,859條比對到了豬的參考基因組(11.1)，平均比對率為80.85% (表1)。利用Cufflinks重建了每個樣本的轉(zhuǎn)錄組，并用Cuffmerge軟件將乏情和發(fā)情母豬的下丘腦、垂體、卵巢的重建轉(zhuǎn)錄組融合成1套無冗余的轉(zhuǎn)錄組，共有55,734條轉(zhuǎn)錄本，利用CNCI軟件預測得到3754條lincRNAs，利用CPAT軟件預測得到4220條lincRNAs，二者的交集為3519條lincRNAs (圖1)。這些lincRNAs分布在除Y染色體以外的所有染色體上(圖2)。

2.2 lincRNAs結(jié)構(gòu)特征分析

以前的研究已經(jīng)表明人和小鼠的lincRNAs與其蛋白編碼基因在結(jié)構(gòu)上有很大的差異，如轉(zhuǎn)錄本長度、外顯子長度和外顯子數(shù)量等。為了鑒定本研究分析的3519個lincRNAs是否也具有這些特征，將這些lincRNAs與Ensembl數(shù)據(jù)庫中所注釋的豬mRNAs (更新于2019年6月，共有48,413個mRNAs)進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)lincRNAs的這些特征與以往的研究十分類似[15,16]：轉(zhuǎn)錄本平均長度(1797 bp)明顯小于mRNA (3551 bp) (圖3A)，外顯子平均長度(571 bp)大于mRNA (285 bp) (圖3B)，外顯子平均個數(shù)(3.1個)小于mRNA (12個) (圖3C)。

表2 引物序列信息

圖2 lincRNAs在染色體上的分布

圖3 lincRNAs和mRNAs轉(zhuǎn)錄本長度、外顯子長度和外顯子個數(shù)比較

A：轉(zhuǎn)錄本長度比較；B：外顯子長度比較；C：外顯子個數(shù)比較。

2.3 差異表達lincRNAs和差異表達mRNAs的表達譜

為探討lincRNAs的功能，利用DEseq軟件對乏情組和發(fā)情組下丘腦–垂體–卵巢軸中的lincRNAs進行差異表達分析。共有17個lincRNAs存在差異表達，以發(fā)情組為對照組，其中12個上調(diào)表達，5個下調(diào)表達(FC≥2，<0.05) (表3)。這17個lincRNAs中，TCONS_00035245上調(diào)倍數(shù)最高(log2FC值為15.665)，TCONS_00032971下調(diào)倍數(shù)最高(log2FC值為16.210)。散點圖(圖4A)揭示了這17個lincRNAs在兩組間的變化情況，聚類分析熱圖(圖5A)揭示了這17個lincRNAs在不同樣本間表達模式的關(guān)系，即乏情組的3種組織聚為一類，發(fā)情組的3種組織聚為一類，在兩組間都是垂體和卵巢的表達模式更為相似，聚為一小類。

同時，對mRNAs差異表達分析顯示，共有72 mRNAs存在差異表達，以發(fā)情組為對照，其中的35個上調(diào)，37 個下調(diào)(FC≥2，<0.05)。在一個組(乏情組或發(fā)情組)平均表達量較高，且在另一組表達量大于1 (乏情組或發(fā)情組)的17個mRNAs具體情況如表4所示。同樣，散點圖(圖4B)揭示了這72個mRNAs在兩組間的變化情況，聚類分析熱圖(圖5B)揭示了這72個mRNAs在不同樣本間表達模式的關(guān)系，該模式關(guān)系與上述的17個lincRNAs相似。

2.4 差異表達lincRNAs驗證

為了驗證RNA-seq結(jié)果的可靠性，選取4個差異表達的lincRNAs進行驗證(圖6)。RNA-seq生物信息學分析篩選的17個差異表達lincRNAs均為與對照組相比在下丘腦、垂體、卵巢3種組織中表達趨勢一致的lincRNAs。qRT-PCR驗證結(jié)果顯示，TCONS_00012288在下丘腦(圖6A)有上調(diào)趨勢(>0.05)，TCONS_00001098在卵巢(圖6C)有下調(diào)趨勢(>0.05)，但RNA-seq結(jié)果為TCONS_00012288表達下調(diào)，TCONS_00001098表達上調(diào)。除上述兩種情況外，其他所有l(wèi)incRNAs在下丘腦、垂體和卵巢中的結(jié)果均與RNA-seq相同，即上調(diào)的lincRNAs與對照組相比，在下丘腦、垂體和卵巢中均為上調(diào)的趨勢，下調(diào)的lincRNAs與對照組相比，在下丘腦、垂體、卵巢中均為下調(diào)的趨勢。

表3 17個差異表達lincRNAs相關(guān)信息

圖4 差異表達lincRNAs和mRNAs散點圖

A：差異表達lincRNAs散點圖；B：差異表達mRNAs散點圖。

圖5 差異表達lincRNAs和mRNAs聚類分析熱圖

A：差異表達lincRNAs聚類分析熱圖；B：差異表達 mRNAs聚類分析熱圖。

表4 17個差異表達的mRNAs相關(guān)信息

圖6 差異表達lincRNAs的qRT-PCR驗證

A：差異表達lincRNAs在下丘腦中的相對表達量；B：差異表達lincRNAs在垂體中的相對表達量；C：差異表達lincRNAs在卵巢中的相對表達量。*表示<0.05，有統(tǒng)計學差異；**表示<0.01，差異顯著。

2.5 GO富集和KEGG通路分析

為了預測差異表達lincRNAs的功能，對17個差異表達的lincRNAs經(jīng)Pearson相關(guān)分析共得到256個共表達基因。這些基因前30富集的GO條目如圖7所示。GO分析表明與lincRNAs共表達基因最富集條目為正調(diào)控NF-kappa轉(zhuǎn)錄因子的活動(生物學過程，GO:0051092)、蛋白磷酸酶1(細胞組分，GO:00164)和細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(分子功能，GO:000469)。此外，KEGG通路分析表明，與lincRNAs共表達基因主要與疾病的發(fā)生發(fā)展、抗原加工遞呈、T細胞受體信號通路和細胞粘附分子等通路相關(guān)(圖8)。

2.6 lincRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)分析

17個差異表達的lincRNAs和72個差異表達的mRNAs，在分析其存在共表達關(guān)系的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了lincRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)(圖9)。在這個網(wǎng)絡(luò)中共包括89個節(jié)點和274個關(guān)系對，其中有174個正調(diào)控關(guān)系對，100個負調(diào)控關(guān)系對。此外，分析還顯示，1個mRNA可能與1~11個lincRNAs相關(guān)，而1個lincRNA則與3~33個mRNAs相關(guān)。

3 討論

近年來研究表明，越來越多的lincRNAs參與哺乳動物的生殖調(diào)控，如lincRNA-介導哺乳動物X染色體失活[9]，lincRNA-在黃體形成和妊娠維持中起重要作用[17]，lincRNA-和與人類的胎盤和胎兒發(fā)育密切相關(guān)[18]。與人類和其他哺乳動物相比，lincRNAs是如何調(diào)控母豬生殖活動的還未見報道[19,20]。本研究首次對乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中的lincRNAs進行了鑒定和分析，系統(tǒng)研究了乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中差異表達lincRNAs和mRNAs的比較圖譜，并對其生物學功能進行了初步的探索，為深入研究lincRNAs在初產(chǎn)母豬情期啟動中的作用提供分子生物學參考，也為深入闡明初產(chǎn)母豬復雜的生殖機制提供了新的分子標記方向。

本研究共鑒定出3519條lincRNAs，這些lincRNAs的轉(zhuǎn)錄本平均長度為1797 bp，外顯子平均長度為571 bp，外顯子平均個數(shù)為3.1，分布在除Y染色體以外的所有染色體上。與蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本相比較，這些lincRNAs具有較短的轉(zhuǎn)錄本長度、較少的外顯子個數(shù)和較長的外顯子長度，這些特征與以往的研究報導一致[15,16]。在這些lincRNAs中共有17個存在差異表達，以發(fā)情組為對照其中12個上調(diào)，5個下調(diào)。同時也對mRNAs的表達情況進行了分析，發(fā)現(xiàn)共有72個mRNAs存在差異表達，以發(fā)情組為對照其中35個上調(diào)表達，37個下調(diào)表達。

圖7 共表達基因最富集的前30個GO條目

GO：ID代表該功能在GO數(shù)據(jù)庫中的編號。

lincRNAs通常不編碼蛋白質(zhì)，而是通過與染色體或蛋白質(zhì)結(jié)合來實現(xiàn)自身的功能，特別是與某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。最近的研究已經(jīng)表明lincRNAs的生物學功能可以通過與之共表達的基因來預測。為了進一步探討差異表達lincRNAs對初產(chǎn)母豬情期啟動等生殖活動的影響，對與之共表達的256個基因進行了GO富集和KEGG通路分析。對發(fā)情母豬而言，共表達基因富集到的MAP激酶活性(GO：0004709)、細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(GO：0004693)、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶復合物(GO：0000307)和膠原分解過程(GO：0030574)等GO條目都直接或間接與母豬發(fā)情生物學機制相關(guān)。動物發(fā)情最顯著的生理特征是卵巢上的卵泡發(fā)育成熟并排卵，在發(fā)情期卵母細胞受到促性腺激素的刺激后恢復第一次減數(shù)分裂，在這一過程中卵母細胞發(fā)生了一系列的變化，如染色體聚集、核仁解體、生發(fā)泡破裂(GVBD)、紡錘體組裝和排出第一極體(PB1)[21~24]。成熟促進因子(maturation promoting factor, MPF)在哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，它發(fā)揮活性的催化亞基就是由細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶構(gòu)成[25,26]。在豬卵丘卵母細胞復合體培養(yǎng)過程中抑制MPF的活性，卵母細胞減數(shù)分裂成熟顯著受阻，同時MPF活性還影響卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程中母源基因的表達[27]。在發(fā)育不良的豬卵母細胞內(nèi)，MPF催化亞基和調(diào)節(jié)亞基的mRNA和蛋白表達水平都顯著降低[28]。這說明MPF的高水平表達及正常激活在豬卵母細胞成熟過程中起關(guān)鍵作用。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是一類廣泛存在于真核細胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程中也具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK調(diào)控卵母細胞減數(shù)分裂過程中微管和染色質(zhì)的行為，在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂時，即使MPF的活性被抑制，MAPK依然能夠誘導卵母細胞染色質(zhì)凝聚和紡錘體形成[29,30]。在豬卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程中，用MAPK專用抑制劑抑制MAPK的活性，染色體分離、第一極體排出和MⅡ期紡錘體的形成都被抑制[31]。另外，GO條目膠原分解過程(GO：0030574)與發(fā)情動物的排卵行為密切相關(guān)。在蛋白分解酶的作用下，排卵前卵泡頂端膠原分解和細胞死亡是卵泡即將破裂排卵的標志。因此推測，對發(fā)情母豬而言，差異表達lincRNAs主要是通過調(diào)控卵母細胞的減數(shù)分裂成熟過程來影響母豬的生殖活動。對乏情母豬而言，最值得關(guān)注的GO條目是正調(diào)控NF-kB轉(zhuǎn)錄因子的活性(GO:0051092)，該條目在分子功能模塊最為富集。NF-kB作為信號傳導通路的中樞，參與許多生物過程的調(diào)控，如炎癥和免疫反應(yīng)、細胞增殖和凋亡、細胞分化等[32~35]。NF-kB異?；罨烧{(diào)節(jié)與細胞增殖和凋亡有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控細胞的增殖和凋亡，并且已有研究證實NF-kB具有促進細胞凋亡的作用，NF-kB亞單位的種類及數(shù)量在細胞凋亡中起著決定性的作用[36,37]。研究表明NF-kB直接參與豬卵巢細胞的增殖和分泌活動，NF-kB的兩個亞基P65和P50均有抑制豬卵巢顆粒細胞分化的作用，且P50在過表達時，促進了顆粒細胞的凋亡[38,39]。因此推測，差異表達的lincRNAs可能通過異?；罨疦F-kB信號通路，抑制了卵巢細胞的分化，促進了顆粒細胞的凋亡，引起了卵泡閉鎖，最終導致母豬乏情。

Pathway：ID代表該通路在KEGG數(shù)據(jù)庫中的編號。

藍色節(jié)點代表差異表達lincRNAs，黃色節(jié)點代表差異表達mRNAs，綠線代表正相關(guān)，紅線代表負相關(guān)。

本研究利用lincRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)分析來確定差異表達的lincRNAs和差異表達的mRNAs之間的關(guān)系。在這個lincRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)中，基因關(guān)聯(lián)到的lincRNAs (11個)最多，在人體內(nèi)該基因編碼的蛋白NIBP參與膜泡運輸過程，增強TNTα誘導的NF-kB活性，直接與IKK和MAP3K14相互作用，參與NF-kB信號通路的經(jīng)典激活和替代激活[40,41]，NIBP在進化過程中高度保守，而豬又擁有與人類極為相似的基因特征，因此，推測差異表達的lincRNAs通過調(diào)控基因的表達來參與NF-kB信號通路的激活過程，從而影響母豬的生殖活動。另外，該網(wǎng)絡(luò)與TCONS_00009672共表達的基因與卵母細胞的減數(shù)分裂成熟密切相關(guān)。是一個休眠的母源mRNA，在卵母細胞成熟過程中被招集并翻譯來調(diào)控組蛋白的去乙?；c成熟相關(guān)的組蛋白乙?；浇档蛯β涯讣毎麥p數(shù)分裂成熟正常進行及染色體準確分離至關(guān)重要，被SiRNA耗盡的卵母細胞出現(xiàn)了嚴重的染色體錯排、著絲粒–微管連接不當、SAC功能受損、胞質(zhì)分裂缺陷和MⅡ非整倍體發(fā)生率增加[42,43]。因此，在豬下丘腦–垂體–卵巢軸中的鑒定TCONS_ 00009672很有可能也是通過調(diào)節(jié)基因來實現(xiàn)對卵母細胞成熟發(fā)育的影響，從而影響母豬的發(fā)情活動，詳盡的機理還得進一步的挖掘探討。

本研究通過RNA-seq技術(shù)分析了乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中l(wèi)incRNAs的表達圖譜，并對差異表達lincRNAs的功能進行初步分析，發(fā)現(xiàn)這些lincRNAs主要與卵母細胞的減數(shù)分裂成熟、卵巢細胞分化及顆粒細胞凋亡等生殖活動相關(guān)，但與重要生殖激素相關(guān)的生物學過程并未預測到，存在測序沒有生物學重復，預測到的差異表達lincRNAs并不全面所致的可能。

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Comparison and analysis of lincRNAs expression profile in the hypothalamic-pituitary-ovarian axis of anestrous and estrous primiparous sows

Qiaoling Ren1, Jiaqing Zhang1, Dongfeng Lu2, Jing Wang1, Junfeng Chen1, Qiang Ma1, Xianxiao Bai1, Hongxiao Guo1, Binwen Gao1, Baosong Xing1

The normal estrus in weaned primiparous sows has a great impact on pig production and abnormal estrus is the main reason for the elimination of primiparous sows. In this study, we studied the long intergenic noncoding RNAs (lincRNAs) in the hypothalamic-pituitary-ovarian axis of anestrous and estrous primiparous sows. These long intergenic noncoding RNAs (lincRNAs) were screened and compared through RNA-seq analysis. The expression profiles of lincRNAs were obtained and their characteristics and functions were preliminarily analyzed. There are 3519 novel lincRNAs identified in the hypothalamic-pituitary-ovarian axis of anestrous and estrous primiparous sows. Compared with estrous primiparous sows, 17 differentially expressed lincRNAs were indentified, including 12 up-regulated lincRNAs and 5 down-regulated lincRNAs (FC≥2,<0.05). The four lincRNA transcripts obtained through selection were verified by qRT-PCR, which are consistent with the RNA-seq results. The GO, KEGG pathway, and lincRNA-mRNA co-expression network analysis of these 17 lincRNAs revealed that these lincRNAs were mainly involved in reproductive activities, such as oocyte meiosis mature, ovarian cells differentiation and granulosa cells apoptosis. The results enriched the data resources of pig lincRNAs and provided useful information for further research about the reproductive performance of primiparous sows.

lincRNAs; anestrus; estrus; primiparous sows; hypothalamic-pituitary-ovarian axis

2019-11-14;

2020-02-29

河南省農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新創(chuàng)意項目(編號：2020CX06)，河南省重點研發(fā)專項(編號：182102110063)，河南省財政預算科研專項項目(編號：2019CY015)和河南省農(nóng)業(yè)科學院自主創(chuàng)新項目(編號：2019ZC42)資助[Supported by Science and Technology Innovation Program (No. 2020CX06), Key Special Rresearch and Development Program of Henan Province (No. 182102110063), Henan Province Financial Budget for Scientific Research Program (No. 2019CY015), and the Program for Independent Innovative Research in Henan Academy of Agricultural Sciences (No. 2019ZC42)]

任巧玲，碩士，副研究員，研究方向：豬的育種與營養(yǎng)。E-mail: renql76@163.com

張家慶，博士，助理研究員，研究方向：豬的育種與繁殖。E-mail: zjq8650612@163.com

任巧玲和張家慶為并列第一作者。

邢寶松，博士，副研究員，研究方向：豬的育種與管理。E-mail: baosong@126.com

10.16288/j.yczz.19-347

2020/3/17 10:34:49

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20200316.1144.002.html

(責任編委: 李明洲)