王澤鑫， 關(guān)利君， 李建明， 王志超， 薛夢(mèng)若， 秦孝軍

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 介入放射科， 呼和浩特 010050

肝癌為目前全球范圍內(nèi)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年約有60萬(wàn)人死于肝癌，近10年來(lái)，隨著現(xiàn)代診斷技術(shù)以及外科手術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，肝癌的臨床診斷和外科手術(shù)治療已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步[1]。但肝癌發(fā)病較為隱匿，患者早期臨床癥狀無(wú)特異性，大部分患者臨床確診時(shí)已經(jīng)處于疾病中晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，患者5年生存率較低[2-3]。研究[4]表明，microRNA-21(miR-21)與肝癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但miR-21對(duì)肝癌的具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。Wnt信號(hào)通路具有明顯的促癌作用，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而Wnt2是Wnt信號(hào)通路中一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，研究[5]證實(shí)，在惡性腫瘤細(xì)胞中Wnt2蛋白高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。miR-21是否通過(guò)Wnt信號(hào)通路影響肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究擬探討miR-21靶向調(diào)控Wnt2基因?qū)Ω伟┘?xì)胞HepG2增殖與遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源 胚腎細(xì)胞株HEK293、肝癌細(xì)胞株HepG2以及正常肝細(xì)胞株LO2均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，青霉素-鏈霉素混合溶液(美國(guó)Hyclone公司)，澳洲胎牛血清(美國(guó)Thermo公司)，0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Thermo公司)，miR-21抑制劑及其陰性對(duì)照(上海吉碼生物科技有限公司)，LipofectaminTM 2000(美國(guó)Invitrogen公司)，質(zhì)粒提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)，兔抗人Wnt2多克隆抗體(武漢中美科技有限公司)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，HRP標(biāo)記二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，四甲基氮唑鹽(MTT，美國(guó)Sigma公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞miR-21表達(dá) 使用Trizol提取HepG2細(xì)胞以及LO2細(xì)胞中總RNA，加入Trizol裂解后使用氯仿/異丙醇處理，收集白色RNA沉淀；75%乙醇洗滌，離心后棄取上清。晾干后采用DEPC水溶解，合成cDNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s，(95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s)35個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法表示miR-21相對(duì)表達(dá)量。操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1天，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)(1×105/孔)，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，換為無(wú)血清的培養(yǎng)基，采用Lipofectamine脂質(zhì)體法將miR-21抑制劑及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，分別作為抑制劑組及對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48 h后，采用熒光定量PCR檢測(cè)抑制劑組與對(duì)照組miR-21表達(dá)水平，miR-21檢測(cè)方法參照1.3.1，以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染48 h后消化細(xì)胞，接種至96孔板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)24、48、72 h，每孔分別加入5 μg/μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入DMSO，震蕩10 min，檢測(cè)酶標(biāo)儀490 nm下各孔吸光值，設(shè)空白對(duì)照判斷各孔細(xì)胞增殖情況，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將HepG2細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，消化收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，參照Annein V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，染色15 min后上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 按照上述步驟轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，常規(guī)洗滌、消化，離心5 min(1000 r/min)，收集細(xì)胞后使用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，取150 μl將其接種于Transwell小室的上室，然后使用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μl接種于下室內(nèi)，培養(yǎng)12 h后，將上室內(nèi)的細(xì)胞使用棉簽擦去，95%甲醇固定10 min，PBS洗滌，結(jié)晶紫染色30 min，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。

1.3.6 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后向每孔細(xì)胞內(nèi)加入200 μl蛋白裂解液，冰上裂解30 min后將其轉(zhuǎn)入EP管內(nèi)，離心10 min(12 000 r/min)，取上清并使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每組取等量的蛋白樣品→SDS-PAGE凝膠電泳→轉(zhuǎn)膜→5%脫脂奶粉室溫封閉→Wnt2一抗封閉過(guò)夜(4 ℃)→室溫下孵育二抗1 h→ECL化學(xué)發(fā)光法顯色→凝膠成像儀觀察，Wnt2蛋白相對(duì)表達(dá)量以目標(biāo)條帶與內(nèi)參GAPDH的光密度值表示。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 構(gòu)建基因A 3′UTR的雙熒光報(bào)告質(zhì)粒，分別在HepG2細(xì)胞及HEK293細(xì)胞中按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行雙熒光報(bào)告，使用miR-21抑制劑及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染，以驗(yàn)證miR-21與Wnt2基因的關(guān)系。各組相對(duì)熒光強(qiáng)度以螢火蟲(chóng)熒光素酶強(qiáng)度/海腎熒光強(qiáng)度比值表示。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑對(duì)HepG2細(xì)胞miR-21表達(dá)的影響 HepG2細(xì)胞miR-21相對(duì)表達(dá)水平(1.978±0.035)明顯高于LO2細(xì)胞(1.586±0.022)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.424,P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后，抑制劑組miR-21相對(duì)表達(dá)水平(0.857±0.017)較對(duì)照組顯著降低(1.684±0.039)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=33.669,P<0.05)。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響 抑制劑組HepG2細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組顯著降低(P值均<0.05)(表1)。

抑制劑組穿過(guò)Tranwell小室的細(xì)胞數(shù)(83.72±15.06)顯著低于對(duì)照組(147.85±20.64)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.347,P<0.05)。抑制劑組細(xì)胞凋亡率(25.67%±3.95%)明顯高于對(duì)照組(10.27%±2.14%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.937,P<0.05)(圖1)。

表1 轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

圖1轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑HepG2細(xì)胞凋亡情況

2.3 轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑對(duì)HepG2細(xì)胞Wnt2表達(dá)的影響 抑制劑組HepG2細(xì)胞Wnt2相對(duì)表達(dá)水平(0.862±0.127)明顯低于對(duì)照組(1.306±0.218)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.048,P<0.05)(圖2)。

2.4 miR-21對(duì)Wnt2的靶向調(diào)控作用驗(yàn)證 TargetScan軟件發(fā)現(xiàn)Wnt2可能是miR-21的潛在靶點(diǎn)，miR-21抑制劑可顯著抑制野生型Wnt2-3′ UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性(0.972±0.102 vs 0.612±0.092，t=4.219，P<0.001)，而對(duì)突變型Wnt2-3′ UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性并無(wú)明顯影響(0.982±0.093 vs 0.911±0.128，t=0.972，P>0.05)。

圖2 Wnt2蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

microRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性小分子非編碼單鏈RNA，約18～25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，具有高度保守性[6-7]。microRNA可通過(guò)Watson-Crick堿基互補(bǔ)匹配原則對(duì)靶mRNA進(jìn)行降解或抑制翻譯來(lái)調(diào)控蛋白的表達(dá)情況[8]。學(xué)者[9-10]預(yù)測(cè)，人類基因中大約有1000個(gè)microRNA參與機(jī)體30%的蛋白編碼基因，在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化以及繁殖等多個(gè)方面均發(fā)揮著重要作用。越來(lái)越多的研究[11-13]證實(shí)，miR-21作為一種新的原癌基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。

miR-21位于17號(hào)染色體短臂FRA17B脆性區(qū)域上，研究證明miR-21在多種腫瘤中表達(dá)顯著升高，參與癌癥相關(guān)基因的表達(dá)。肝癌作為世界范圍內(nèi)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于診斷和治療困難，患者總體預(yù)后較差[14]。研究[15]顯示，microRNA參與癌細(xì)胞免疫逃逸、腫瘤轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管的生成過(guò)程。臨床研究[16]顯示，在肝癌組織中miR-21明顯升高，并與肝癌患者臨床病理特征具有密切聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，HepG2肝癌細(xì)胞miR-21相對(duì)表達(dá)水平明顯高于正常肝細(xì)胞；而轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后，抑制劑組HepG2細(xì)胞與對(duì)照組比較，miR-21相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，表明miR-21在肝癌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，與學(xué)者報(bào)道結(jié)果[17]相似。miR-21可能是肝癌促癌基因之一，其高表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究顯示，抑制劑組的HepG2細(xì)胞增殖、遷移能力明顯低于對(duì)照組，而細(xì)胞凋亡率則明顯高于對(duì)照組，表明miR-21表達(dá)受到抑制后，可有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步提示了miR-21與肝癌細(xì)胞增殖、遷移等惡性行為有關(guān)，與臨床報(bào)道結(jié)果[18]相一致。

Wnt是一種分泌性糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為40 000，在多種組織中均有表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞外界因素發(fā)生變化時(shí)，可導(dǎo)致Wnt過(guò)度激活，進(jìn)而發(fā)生失調(diào)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)育異常甚至形成腫瘤[19-20]。Wnt信號(hào)通路在肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌以及胰腺癌等多種惡性腫瘤中均有一定的促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移的作用[21]。Wnt2作為Wnt信號(hào)通路中的一種重要分子，研究[22]顯示，Wnt2的大量分泌可激活Wnt2-β連環(huán)蛋白信號(hào)通路，最終促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，且Wnt2表達(dá)與惡性腫瘤侵襲潛能、腫瘤分期及臨床分級(jí)呈正相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，抑制劑組HepG2細(xì)胞Wnt2相對(duì)表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，提示miR-21表達(dá)受到抑制后，細(xì)胞中Wnt2蛋白表達(dá)明顯降低，從而可抑制Wnt信號(hào)通路的過(guò)度激活。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)，Wnt2是miR-21的潛在靶基因，并且miR-21對(duì)Wnt2表達(dá)存在顯著調(diào)控作用，表明在肝癌中miR-21可能扮演促癌的microRNA角色。miR-21在肝癌中異常高表達(dá)促進(jìn)Wnt2蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)以及惡性侵襲的潛能；而抑制miR-21表達(dá)，有助于促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡以及增殖抑制。miR-21有望成為肝癌治療的潛在靶點(diǎn)之一[23-24]。

綜上所述，抑制miR-21表達(dá)可有效抑制HepG2細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，并抑制Wnt信號(hào)通路的過(guò)度激活，可能成為肝癌治療的潛在靶基因之一，值得進(jìn)一步深入研究分析。