薛 磊，趙漢文，李小斌，郭 斌，王 穎，郭志剛，潘廣樂，李 軒

(陜西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，陜西 寶雞 721013)

煙草是我國重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，在國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。近年來，隨著我國簽署《世界衛(wèi)生組織煙草控制框架公約》，吸煙與健康問題日益受人們重視。

焦油是煙草燃燒時(shí)煙氣中主要的有害物質(zhì)，其所包含的多種成分直接影響著煙草的危害性[1]。目前國內(nèi)常用的煙草物理減害降焦技術(shù)多為通過提高濾嘴過濾和吸附性能，或采用激光打孔接裝紙、高透氣度成型紙和卷煙盤紙，以增加抽吸時(shí)的空氣進(jìn)入量來稀釋主流煙氣，來降低煙氣中焦油和有害成分含量[2]。然而，現(xiàn)有物理減害降焦技術(shù)在降低卷煙焦油時(shí)，會(huì)造成煙氣的香氣明顯損失，煙氣有發(fā)干等不良感官現(xiàn)象，影響煙草吸食的品質(zhì)[3]。

研究表明，煙葉中淀粉[4,5]、蛋白質(zhì)[6]、纖維素和果膠[7]等含量不僅影響煙葉的感官質(zhì)量，同時(shí)這些大分子有機(jī)物在不完全燃燒時(shí)可顯著影響煙氣的總粒相物、焦油[8,9]，和氫氰酸(HCN)、亞硝胺類(NNK)、苯并[a]芘(B[a]P)和巴豆醛等重點(diǎn)有害物質(zhì)[10]的釋放量。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)微生物在煙葉大分子有機(jī)物的分解與轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用[11～13]，即可通過微生物發(fā)酵來降低煙葉中淀粉[4]、蛋白質(zhì)[6]、纖維素[14]和果膠[15]等物質(zhì)含量以提升煙葉品質(zhì)。但這些研究僅針對產(chǎn)單一酶活的微生物來研究其對煙葉品質(zhì)的影響，對于同時(shí)產(chǎn)多種酶活性的煙草微生物及其對煙葉品質(zhì)改善和降低有害成分釋放作用的研究報(bào)道較少。

因此，筆者研究通過對煙草微生物資源進(jìn)行分離收集，并對其產(chǎn)多種酶能力和煙絲發(fā)酵效果進(jìn)行篩選，研究煙草微生物對煙葉品質(zhì)和有害成分釋放量的影響，探討將其應(yīng)用于煙草發(fā)酵的可能，為煙草增香減害微生物資源的發(fā)掘及其應(yīng)用提供技術(shù)指導(dǎo)與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試煙葉 微生物分離煙葉樣品來源：云南省昆明、曲靖、保山等產(chǎn)地的醇化煙葉。

供試煙絲：配方葉組煙絲，煙絲水分含量為12%。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基[16]：細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用PDA培養(yǎng)基，放線菌采用高氏1號培養(yǎng)基。菌種液體培養(yǎng)采用LB液體培養(yǎng)基。

產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基：淀粉酶篩選培養(yǎng)基[4]，蛋白酶篩選培養(yǎng)基[6]，纖維素酶篩選培養(yǎng)基[14]，果膠酶篩選培養(yǎng)基[15]。

1.2 方法

1.2.1 煙葉表面微生物分離 稱取煙葉樣品10.0 g，采用逐級稀釋法[16]，挑取單菌落，純化后備用。

1.2.2 菌株酶活性篩選 將分離到的菌株鑒定去重后，點(diǎn)接于產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，以確定菌株產(chǎn)淀粉酶[4]、蛋白酶[6]、纖維素酶[14]或果膠酶[15]的功能，并測量菌株周圍透明水解圈和菌落直徑(淀粉酶平板需碘液染色，纖維素酶和果膠酶平板需剛果紅溶液染色)，計(jì)算酶活比值：

酶活比值=(水解圈直徑-菌落直徑)/菌落直徑

1.2.3 煙絲發(fā)酵試驗(yàn)與感官評吸 選取產(chǎn)酶和降解篩選試驗(yàn)表現(xiàn)較好的菌株，將單菌株接種于LB培養(yǎng)液中，37 ℃、180 r·min-1下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h。菌液于4 ℃、8 000 r·min-1離心10 min，將收集的單菌株菌體用無菌水配制成菌懸液，均勻噴灑在供試煙絲表面，以等量無菌水處理做對照，置于32 ℃、濕度80%的恒溫恒濕箱中發(fā)酵培養(yǎng)46 h后，將煙絲烘干至水分為12%，備用。

將發(fā)酵后的煙絲樣品在25 ℃、相對濕度65%條件下平衡24 h，卷制成卷煙。由具有卷煙感官評吸技術(shù)資格的7人組成感官評吸評委組，參照國家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5606.4-2005、YC/T 415-2011采用整體循環(huán)法進(jìn)行感官質(zhì)量綜合評價(jià)。

1.2.4 理化指標(biāo)和致香成分測定 理化指標(biāo)檢測：參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 159-2002、YC/T 160-2002、YC/T 162-2002、YC/T 173-2003 及YC/T 161-2002對煙絲中總糖和還原糖、煙堿、氯、鉀和總氮進(jìn)行檢測，并檢測煙絲淀粉[5]、蛋白質(zhì)[6]和氨基酸[17]、纖維素和果膠[7]含量變化。

致香成分測定：挑選煙支重量、吸阻符合要求的煙支，在標(biāo)準(zhǔn)抽吸條件下通過吸煙機(jī)抽吸，對樣品主流煙氣中的粒相物用濾片進(jìn)行捕集，將濾片捕集物萃取濃縮至一定體積后進(jìn)行GC/MS分析。GC/MS色譜條件：色譜柱：DB-35MS彈性石英毛細(xì)管柱(60 m × 0.32 mm × 0.25 μm)；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣口溫度：240℃；載氣：He；流速：1 mL·min-1；接口溫度：250 ℃；升溫梯度：從初始溫度50 ℃保持2 min，以3 ℃·min-1升溫至160 ℃，保留1 min，再以4 ℃·min-1升溫至280 ℃，保留時(shí)間20 min；離子源：EI源；電子能量：70 eV；掃描范圍：35～455 amu；圖譜庫：NBS，WILEY標(biāo)準(zhǔn)譜庫。

1.2.5 主流煙氣指標(biāo)和有害成分釋放量測定及危害性指數(shù)計(jì)算 參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5606.5-2005測定主流煙氣中總粒相物、焦油、煙堿、CO等煙氣指標(biāo)，參照國家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23356-2009、YC/T 253-2008、GB/T 23228-2008、YC/T 377-2010、GB/T 21130-2007、YC/T 255-2008、YC/T 254-2008測定主流煙氣中CO，HCN，NNK，NH3，B[a]P，苯酚和巴豆醛的釋放量，并參照文獻(xiàn)[18]計(jì)算煙氣危害性指數(shù)H，計(jì)算公式如下：

H=(∑Ci/Ri)×(10/7)

式中，H表示煙氣危害性指數(shù)；C表示各項(xiàng)有害成分煙氣實(shí)測值，R表示各項(xiàng)有害成分參考值。CO，HCN，NNK，NH3，B[a]P，苯酚和巴豆醛釋放量參考值分別取每支14.20 mg、146.30 μg、5.50 ng、8.10 μg、10.90 ng、17.40 μg和18.60 μg-1[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel和DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉中微生物分離與鑒定

從供試煙葉樣品中共分離得到可培養(yǎng)細(xì)菌菌株159株。提取細(xì)菌菌株DNA，擴(kuò)增16S rRNA基因序列在EzBioCloud庫中進(jìn)行同源性比對，核苷酸序列比對結(jié)果表明，芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)為供試煙葉樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌中的優(yōu)勢種群。

2.2 微生物產(chǎn)酶功能篩選

產(chǎn)酶和降解特性篩選試驗(yàn)表明(圖1)，多數(shù)細(xì)菌具有產(chǎn)胞外酶的能力，但產(chǎn)酶能力不同。如表1所示，其中，菌株YBM-1、YBM-6、YBG-5、YDP-21和YDP-23同時(shí)具備產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、果膠酶4種胞外酶的能力，其余菌株具備可產(chǎn)2或3種酶的能力，菌株YBM-2僅具備產(chǎn)果膠酶能力。其中，菌株YBM-6產(chǎn)蛋白酶能力相對較強(qiáng)，其酶活比值為6.00；菌株YBG-5產(chǎn)淀粉酶能力較強(qiáng)，其酶活比值為1.18；產(chǎn)纖維素酶能力較高的菌株為YDP-23，其酶活比值達(dá)17.50；菌株YDP-21產(chǎn)果膠酶的酶活比值為16.50。

2.3 微生物發(fā)酵后煙葉感官質(zhì)量變化

由表2可知，不同的菌株對煙葉感官質(zhì)量各指標(biāo)影響存在一定差異。與對照相比，各單菌株對供試煙絲的感官質(zhì)量有不同程度的改善作用。并且，同時(shí)具備產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、果膠酶4種酶能力的菌株對供試煙絲感官質(zhì)量提升作用效果更好。其中，菌株YBG-5較對照樣可明顯改善煙氣狀態(tài)增加煙氣細(xì)膩感；菌株YDP-23可明顯提升煙氣香氣質(zhì)，增加煙氣甜感，提升余味的津潤感，降低雜氣；菌株YBM-6可明顯增加香氣量，降低煙氣的刺激性，改善余味的舒適性。其余菌株發(fā)酵處理對供試煙絲感官質(zhì)量改善效果次之。

選取對供試煙絲感官質(zhì)量各項(xiàng)改善效果較好的菌株YBG-5、YDP-23和YBM-6進(jìn)行配方組合試驗(yàn)，最終形成的復(fù)合微生物配方T1(YBM-6∶YBG-5∶YDP-23=3∶1∶0.5)和T2(YBM-6∶YBG-5∶YDP-23=2∶0.5∶1)對供試煙絲的感官質(zhì)量有進(jìn)一步改善。如表3所示，經(jīng)復(fù)合微生物配方T1、T2發(fā)酵處理樣的感官質(zhì)量得分分別為89.28和88.83，較未經(jīng)微生物發(fā)酵的對照樣分別提升1.13分和0.68。復(fù)合微生物配方T1發(fā)酵處理樣明顯改善煙氣的細(xì)膩度，香氣質(zhì)和香氣量均有增加，雜氣減輕，刺激性減弱。

2.4 復(fù)合微生物發(fā)酵后煙葉化學(xué)成分和香味成分變化

如表4所示，與對照相比，經(jīng)復(fù)合微生物配方T1、T2發(fā)酵處理后，煙絲化學(xué)成分中淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、果膠、總糖、還原糖、總氮和氨基酸含量均有明顯變化，煙堿、氯和鉀含量變化不大。其中，經(jīng)復(fù)合微生物配方T2處理的供試煙絲中淀粉、蛋白質(zhì)和果膠含量較對照明顯降低，總糖、還原糖和總氮含量較對照有明顯增高。此外，復(fù)合微生物配方T1處理的供試煙絲的糖堿比為11.10，較對照提升明顯，T2處理次之。

表1 部分菌株產(chǎn)4種胞外酶活性比值

表2 部分菌株發(fā)酵處理對供試煙絲感官質(zhì)量的影響

注：單項(xiàng)分值為10分，打分單位為0.5分，各項(xiàng)取平均值。

表3 復(fù)合微生物配方發(fā)酵處理對供試煙絲感官質(zhì)量的影響

注：參照國標(biāo)GB5606.4-2005《卷煙 第4部分 感官技術(shù)要求》評價(jià)計(jì)分，各項(xiàng)取平均值。

表4 復(fù)合微生物配方發(fā)酵處理對供試煙絲化學(xué)成分的影響

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)。

表5 復(fù)合微生物配方發(fā)酵處理對供試煙絲香味成分的影響 (μg·支-1)

GC/MS分析結(jié)果表明，經(jīng)復(fù)合微生物配方T1、T2發(fā)酵處理樣和對照樣的煙氣中共同檢測出的香味化合物為52種，T1和T2處理樣煙氣中香味成分總含量較對照分別提升38.05%和16.84%。如圖2所示，復(fù)合微生物配方T1處理樣煙氣中在酮類、醇類、稠環(huán)芳烴類、萜烯類香味成分含量較對照有明顯增加，分別較對照增加了59.52%、47.74%、36.21%和33.70%。其中，具香味化合物如大馬酮、二氫-β-紫羅蘭酮、茄酮、巨豆三烯酮、糠醇、糠醛、3-氧代-α-紫羅蘭醇、植醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-環(huán)檸檬醛、D-檸檬烯、香茅醛、新植二烯、吲哚、麥芽酚等的含量較對照樣有著不同程度的提高(表5)。并且，在復(fù)合微生物配方T1處理樣煙氣中，常見煙草香味成分如麥芽酚含量較對照提升了165.23%，大馬酮含量提升了80.53%，3-氧代-α-紫羅蘭醇含量提升了74.63%，巨豆三烯酮含量提升了69.03%。

2.5 復(fù)合微生物發(fā)酵后煙葉有害成分變化

由表6可知，經(jīng)上述復(fù)合微生物配方T1和T2發(fā)酵處理后的供試煙絲的焦油量每支分別為6.05 mg和6.20 mg，較對照樣分別下降9.43%和7.19%，CO含量分別下降0.50 mg和0.45 mg。同時(shí)，復(fù)合微生物配方T1和T2發(fā)酵處理降低了吸入煙氣的單口焦油量，較對照分別下降14.99%和14.02%。

表6 復(fù)合配方微生物發(fā)酵處理對供試煙絲常規(guī)有害成分的影響

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)。

表7 復(fù)合配方微生物發(fā)酵處理對供試煙絲主流煙氣中7項(xiàng)有害成分及危害性的影響

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)。

表7為供試煙絲主流煙氣中7種有害成分的釋放量，與對照樣相比，經(jīng)復(fù)合微生物配方T1和T2發(fā)酵處理后主流煙氣中有害成分的釋放量均有不同程度的下降。其中復(fù)合微生物配方T1處理樣的主流煙氣中的HCN、巴豆醛、NH3、苯酚和B[a]P含量較對照樣分別下降16.50%、13.74%、9.83%、9.24%和7.05%。經(jīng)復(fù)合微生物配方T1發(fā)酵處理后煙氣危害性指數(shù)為5.64，較對照下降0.51，T2發(fā)酵樣煙氣危害性指數(shù)為5.69，較對照下降0.46。

3 討論

目前，利用微生物發(fā)酵技術(shù)處理煙葉，以提高煙葉品質(zhì)是煙草行業(yè)的重點(diǎn)研究方向[12]。研究表明，微生物可通過生物酶的催化直接或間接參與煙葉中原物質(zhì)的分解和新物質(zhì)的生成，進(jìn)而影響煙葉品質(zhì)[13]。與國內(nèi)外現(xiàn)有利用具產(chǎn)單一酶特性的微生物[4,6,14,15]進(jìn)行發(fā)酵改善煙葉品質(zhì)的研究不同，本研究從具產(chǎn)多種酶特性的微生物及其作用于煙葉化學(xué)成分角度開展，篩選到可同時(shí)產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和果膠酶的多酶活功能型菌株，組合而成的復(fù)合微生物配方不僅對煙葉品質(zhì)具有明顯的提升效果，并可有效降低煙氣危害性，這一結(jié)果為煙草增香減害研究提供了新的研究思路。

復(fù)合配方微生物可能的作用機(jī)理在于，其所包含的同時(shí)產(chǎn)多種酶特性的微生物在煙絲發(fā)酵過程中，可通過降解煙葉中的蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素和果膠等大分子物質(zhì)，生成糖類和氨基酸等產(chǎn)物，在后續(xù)煙絲加熱干燥過程中，煙絲中的糖類和氨基酸可作為反應(yīng)底物經(jīng)由美拉德反應(yīng)[20]使得如糠醇、糠醛、2-環(huán)戊烯-1,4-二酮、麥芽酚等[21]具香味的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量增加。并且醇類、酯類、萜烯類和稠環(huán)芳烴類[22]等不同化合物含量的增加，共同促進(jìn)了煙葉香氣品質(zhì)的提升。同時(shí)，由于蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素和果膠等大分子物質(zhì)的降解，使得煙葉在燃燒時(shí)焦油釋放量降低，也減少了煙氣中如NH3、HCN、B[a]P、苯酚和巴豆醛等重點(diǎn)有害物質(zhì)[18,19]生成量，降低了煙氣危害性。

綜上所述，筆者研究的具有同時(shí)產(chǎn)多種酶能力的微生物及其復(fù)合微生物配方可通過上述途徑，使得煙氣中各類香味成分含量明顯增加、有害物質(zhì)含量降低，這對提高煙葉感官質(zhì)量、改善煙葉品質(zhì)、降低有害成分釋放起到了重要作用。筆者研究不僅為煙草微生物技術(shù)發(fā)展提供新的微生物資源，也為煙草微生物發(fā)酵增香減害技術(shù)的發(fā)展提供了重要依據(jù)。