籍佳琦，高凌云，付澤偉，李熙霞，楊麗青，劉文媛，汪 英

目前，肺癌已經(jīng)成為中國(guó)男性發(fā)病率和病死率最高的腫瘤之一[1]，盡管肺癌的靶向治療取得飛速發(fā)展，其5年生存率依舊較低，不足16%[2]，癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是造成肺癌病死率居高不下的主要原因[3]。微小RNA(miRNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼短鏈RNA，許多miRNA與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移侵襲等有關(guān)[3]。miRNA通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促癌或抑癌基因的作用。目前已有研究證實(shí)，miR-454-3p在膀胱癌、乳腺癌等腫瘤中表達(dá)降低，對(duì)人類(lèi)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的負(fù)向調(diào)控作用[4-5]。但是miR-454-3p在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的功能和機(jī)制卻知之甚少。本文旨在驗(yàn)證miR-454-3p在肺癌細(xì)胞株中低表達(dá)，其過(guò)表達(dá)顯著抑制肺癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲能力及其對(duì)BPTF的靶向調(diào)控作用，闡明miR-454-3p在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，以期為肺癌的臨床靶向治療提供新的潛在治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年6月～2018年11月四川省人民醫(yī)院(東院)手術(shù)切除經(jīng)液氮保存的新鮮冷凍組織，包括33例肺腺癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織，癌旁選取距離病變部位>2 cm組織。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情并簽署同意書(shū)，所有標(biāo)本均經(jīng)兩位病理醫(yī)師確診。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料人肺癌細(xì)胞系(H1437、A549、H1299、H1975、H460)、正常肺上皮細(xì)胞(HBE)和293T細(xì)胞，均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。DMEM、RPMI 1640、DMEM-F12培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)，均購(gòu)自Gibco公司。胰酶購(gòu)自Sigma公司，引物購(gòu)自南京金斯瑞公司。PrimeScript RT Reagents Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix EX Taq，均購(gòu)自日本Takara公司。miR-454-3p mimic、雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒，均購(gòu)自廣州銳博公司。Transwell試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技公司?？贵wBPTF(1 ∶1 000)、MMP-2(1 ∶1 000)、MMP-9(1 ∶2 000)、E-cadherin(1 ∶2 000)、N-cadherin(1 ∶2 000)、GAPDH(1 ∶5 000)，均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 H1437、A549、H1299、H1975和H460細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，HBE培養(yǎng)在含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。細(xì)胞融合率達(dá)90%時(shí)，移去培養(yǎng)液并用FBS緩沖液沖洗2次。加入適量胰酶消化后，加入2 mL培養(yǎng)基中止消化。輕輕吹打至細(xì)胞脫落，將懸浮細(xì)胞離心(1 000 r/min×5 min)，重懸后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 miR-454-3p mimic轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞接種到6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)70%～80%融合度時(shí)，采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞；轉(zhuǎn)染前用Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋Lipofectamine 3000和miR-454-3p，混勻，室溫下孵育5 min，加入培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，采用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 RT-PCR采用Trizol試劑盒提取總RNA，定量，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA。RT-PCR采用 SYBR Premix EX Taq。采用2-ΔΔCt法定量，U6作為內(nèi)參。

1.3.4 Western blot法miR-454-3p mimic轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h 后，收集細(xì)胞。使用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE凝膠垂直電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶孵育封閉1 h，用稀釋后的一抗過(guò)夜孵育，TBST洗膜10 min×3次，HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影后曝光，相關(guān)圖像分析軟件進(jìn)行灰度值測(cè)定，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A549細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染miR-454-3p及其對(duì)照24 h后，胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。向96孔板中加入100 μL含細(xì)胞數(shù)約為2 000個(gè)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24、48、72、96 h后，向每孔中加入10 μL的CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的吸光度值。

1.3.6 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)非基質(zhì)膠覆蓋和基質(zhì)膠覆蓋的Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，將各組細(xì)胞胰酶消化后，離心，用不含血清的培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，制備成單細(xì)胞懸液。接種3×104個(gè)細(xì)胞至上室，下室中加入700 μL的20% FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。用棉簽擦去上室未穿過(guò)孔膜的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，15%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察，隨機(jī)選6個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，平均細(xì)胞表示細(xì)胞的遷移能力。侵襲實(shí)驗(yàn)與遷移實(shí)驗(yàn)的區(qū)別是在接種細(xì)胞前，上室預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠。

2 結(jié)果

2.1 miR-454-3p在肺癌組織以及肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-454-3p在肺癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，與癌旁正常組織中的表達(dá)相比，差異有顯著性(P<0.01，圖1)。與人正常肺上皮細(xì)胞(HBE)相比，miR-454-3p在肺癌細(xì)胞系(H1437、 A549、 H1299、H1975和H460)中的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，其中A549的表達(dá)量最低(圖2)。

圖1 miR-454-3p在肺癌和癌旁肺組織中的表達(dá)

圖2 miR-454-3p在不同肺癌細(xì)胞系和正常細(xì)胞中的表達(dá)水平比較

2.2 過(guò)表達(dá)miR-454-3p對(duì)A549肺癌細(xì)胞增殖的影響鑒于miR-454-3p在A549的表達(dá)含量最低，因此選擇A549作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。miR-454-3p mimic轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，RT-PCR定量結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miR-454-3p的mimics)A549細(xì)胞中miR-454-3p的表達(dá)含量明顯高于對(duì)照組(轉(zhuǎn)染mimics-NC)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖3A) CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-454-3p mimic處理顯著抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖(P<0.05，圖3B)。

圖3 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-454-3p mimic后miR-454-3p表達(dá)水平(A)及對(duì)細(xì)胞活力的影響(B)

2.3 上調(diào)miR-454-3p與A549肺癌細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)系采用遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-454-3p對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。無(wú)基質(zhì)膠的Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，miR-454-3p過(guò)表達(dá)組細(xì)胞侵襲能力明顯下降(圖4A)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)miR-454-3p也顯著抑制細(xì)胞的侵襲能力(圖4B)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示過(guò)表達(dá)miR-454-3p可顯著抑制A549肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。

圖4 上調(diào)miR-454-3p能抑制A549肺癌細(xì)胞遷移(A)和侵襲(B)

2.4 miR-454-3p與BPTF 3′UTR的關(guān)系miR-454-3p在肺癌細(xì)胞系中的低表達(dá)，提示其可能是抑癌miRNA。生物信息學(xué)軟件Targetscan和miRanda分析結(jié)果表明，miR-454-3p在BPTF 3′ UTR之間有良好的配對(duì)關(guān)系(圖5A)，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建野生型和突變型的BPTF真核表達(dá)載體。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明：miR-454-3p能顯著降低BPTF 3′ UTR熒光素酶活性(P<0.01，圖5B)，Western blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示，在A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-454-3p可以顯著降低BPTF的表達(dá)(圖5C)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。

圖5 miR-454-3p直接靶向BPTF：A. miR-454-3p與BPTF 3′UTR互補(bǔ)配對(duì)序列；B.各組細(xì)胞中熒光素酶活性的比較：1.miR-454-3p-NC+BPTF-WT；2.miR-454-3p-mimic+BPTF-WT；3.miR-454-3p-NC+BPTF-MUT；4.miR-454-3p-mimic+BPTF-WT，ns為兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C.Western blot法檢測(cè)A549細(xì)胞中BPTF蛋白的表達(dá)水平

2.5 miR-454-3p調(diào)控A549肺癌細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，miR-454-3p過(guò)表達(dá)組中遷移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)降低。此外，miR-454-3p過(guò)表達(dá)顯著抑制侵襲相關(guān)蛋白N-cadherin，而N-cadherin的負(fù)向調(diào)控蛋白E-cadherin的表達(dá)顯著增加(圖6)。

圖6 Western blot法檢測(cè)A549細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

隨著腫瘤生物治療研究的不斷加深和進(jìn)步，從分子生物學(xué)角度尋找肺癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的靶向治療已成為目前研究的熱點(diǎn)[6]。miRNA是一類(lèi)高度保守的內(nèi)源性短鏈mRNA，通過(guò)與靶基因3′UTR相結(jié)合，降解靶基因mRNA或者抑制其翻譯調(diào)控基因的表達(dá)[7-8]。越來(lái)越多的miRNA如miRNA-421、miRNA-527 被報(bào)道參與肺腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為[9-10]。miR-454-3p是近年發(fā)現(xiàn)的參與多種腫瘤過(guò)程的miRNA，miR-454-3p通過(guò)靶向抑癌基因BTG1增強(qiáng)腎癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性[11]，miR-454-3p在膀胱癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，可通過(guò)下調(diào)ZEB2基因的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。以上研究提示miR-454-3p的表達(dá)失調(diào)或功能異常在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能扮演重要的角色，但miR-454-3p在肺癌中的功能及機(jī)制研究未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-454-3p在肺癌組織和肺癌細(xì)胞中的表達(dá)均低于正常肺組織和肺上皮細(xì)胞，提示miR-454-3p可能具有抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，本實(shí)驗(yàn)選取表達(dá)含量最低的肺癌細(xì)胞A549為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，轉(zhuǎn)染miR-454-3p的mimics上調(diào)其表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-454-3p明顯抑制肺癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)降低癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。EMT是具有上皮表型的細(xì)胞在特定的病理生理情況下轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的過(guò)程，表現(xiàn)為丟失上皮細(xì)胞表型E-cadherin，增加vimentin和N-cadherin等間質(zhì)表型，從而使細(xì)胞黏附力下降，遷移和侵襲能力增加[13]。Western blot結(jié)果顯示，miR-454-3p過(guò)表達(dá)可以上調(diào)細(xì)胞中上皮細(xì)胞表型E-cadherin蛋白表達(dá)，間質(zhì)表型N-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，提示miR-454-3p可能抑制肺癌EMT的進(jìn)展，進(jìn)而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力。 此外，本實(shí)驗(yàn)利用Targetscan和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-454-3p的靶基因，最終選定BPTF作為miR-454-3p的候選靶基因。BPTF溴區(qū)PHD結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，近年研究發(fā)現(xiàn)其在人類(lèi)多種腫瘤中高表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[14-15]。BPTF在肺癌細(xì)胞中的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步構(gòu)建含BPTF 3′UTR序列的熒光素酶報(bào)告重組質(zhì)粒，再進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因分析，共轉(zhuǎn)染后熒光素酶的活性受到抑制，提示miR-454-3p可直接與BPTF基因的3′UTR相結(jié)合。A549細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)入miR-454-3p的mimics后，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BPTF蛋白表達(dá)降低， 以上結(jié)果表明miR-454-3p可以負(fù)向調(diào)控BPTF，抑制其表達(dá)。

綜上所述，在肺癌細(xì)胞中miR-454-3p呈低表達(dá)，上調(diào)miR-454-3p能抑制BPTF蛋白表達(dá)、抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。以上結(jié)果為miR-454-3p在肺癌中的調(diào)控機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但是miR-454-3p在肺癌中的臨床意義仍有待于進(jìn)一步探討。