詹飛燕 魏教華 吳仁慶

摘要?目的：觀察電針百會穴、印堂穴對七氟醚麻醉后大鼠認(rèn)知功能的影響，同時(shí)檢測腦組Sonic Hedgehog（Shh）通路標(biāo)志性蛋白水平的變化。方法：納入30只SPF級SD大鼠，隨機(jī)分為空白組、麻醉組及電針組，每組10只?？瞻捉M大僅進(jìn)行模擬捉拿，麻醉組大鼠吸入3.0%七氟醚30 min，隨后用1.5%七氟醚麻醉維持3 h，電針組在此基礎(chǔ)上進(jìn)行電針干預(yù)，連續(xù)干預(yù)7 d。干預(yù)結(jié)束后用Morris水迷宮檢測各組學(xué)習(xí)記憶能力變化，HE染色法觀察各組海馬組織的結(jié)構(gòu)變化，Western blot及Real-Time PCR法檢測各組海馬組織Shh、Gli、PI3K、pAKT蛋白及mRNA的水平變化。結(jié)果：1）Morris水迷宮顯示：麻醉組及電針組大鼠游泳總路程及逃避潛伏期明顯較空白組延長（P<0.05），其中電針組較麻醉組明顯改善（P<0.05）。2）HE染色提示空白組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，麻醉組及電針組大鼠海馬組織均出現(xiàn)明顯結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞排列錯亂，神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯變形縮小，其中電針組海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)較麻醉組改善。3）Western blot及PT-PCR的結(jié)果顯示，麻醉組及電針組大鼠海馬組織Shh、Gli、PI3K、p-AKT蛋白及mRNA表達(dá)較空白組降低（P<0.05），其中電針組較麻醉組改善（P<0.05）。結(jié)論：七氟醚可對認(rèn)知能力產(chǎn)生一定損害效應(yīng)，電針百會穴、印堂穴可明顯提升認(rèn)知能力，其作用機(jī)制可能與激活Shh通路通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞?七氟醚;學(xué)習(xí)記憶能力;百會穴;印堂穴;海馬;Shh通路

Study on Effects of Baihui（GV 20）and Yintang（EX-HN3）on Cognitive Function of Rats After Sevoflurane Anesthesia and Its Mechanism

ZHAN Feiyan，WEI Jiaohua，WU Renqing

（Department of Anesthesiology，United Logistics Support Force 908 Hospital，Nanchang 330000，China）

Abstract?Objective：To observe effects of electroacupuncture at Baihui（GV 20）and Yintang（EX-HN3）on cognitive function after sevoflurane anesthesia in rats，and to detect level changes of Shh pathway marker protein in brain tissue.Methods：Thirty SPF SD rats were included in this study and randomly divided into blank group（n=10），anesthesia group（n=10）and electroacupuncture group（n=10）.The rats in the blank group were only subjected to simulated capture.The rats in the anesthesia group inhaled 3.0% sevoflurane for 30 min，then they were anesthetized with 1.5% sevoflurane for 3 h.On this basis，the electroacupuncture group was treated with electroacupuncture for 7 d.After the intervention，Morris water maze was used to detect changes of learning and memory ability in each group.HE staining was used to observe structural changes of hippocampal tissue in each group.Western blot and Real-Time PCR were used to detect level changes of Shh，Gli，PI3K，pAKT protein and mRNA in hippocampal tissue in each group.Results：The Morris water maze showed that total swimming distance and escape latency in the anesthesia group and electroacupuncture group were significantly longer than those in the blank group（P<0.05），and those in the electroacupuncture group were significantly improved compared with those in the anesthesia group（P<0.05）.2）HE staining showed that the morphology of hippocampal tissue was normal in the blank group，and the hippocampal tissue in the anesthesia group and electroacupuncture group showed obvious structural destruction，disordered arrangement of cells and obvious deformation and reduction of neuron cells.The morphological structure of hippocampus in the electroacupuncture group was better than that in the anesthesia group.3）Western blot and PT-PCR showed that the expressions of Shh，Gli，PI3K，p-AKT protein and mRNA in hippocampus of rats in the anesthesia group and electroacupuncture group were lower than those in the blank group（P<0.05），and those in electroacupuncture group were better than those in the anesthesia group（P<0.05）.Conclusion：Sevoflurane can have a certain damage effect on cognitive ability.Electroacupuncture at Baihui（GV 20）and Yintang（EX-HN3）can obviously improve cognitive ability，and its mechanism may be related to activation of Shh pathway.

Keywords?Sevoflurane; Learning and memory ability; Baihui（GV 20）; Yintang（EX-HN3）; Hippocampus; Shh pathway

中圖分類號：R245文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.013

術(shù)后認(rèn)知障礙（Postoperative Cognitive Dysfunction，POCD）指的是患者手術(shù)麻醉前無認(rèn)知功能障礙，術(shù)后出現(xiàn)注意力、記憶力、定向力等認(rèn)知功能減退表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[1-2]。有數(shù)據(jù)顯示，POCD的老年患者發(fā)生阿爾茲海默病的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于認(rèn)知功能正常的老年人群[3-5]，因此降低POCD發(fā)生率具有重要的臨床意義。學(xué)者認(rèn)為多途徑綜合作用導(dǎo)致POCD的發(fā)生，隨著研究的不斷深入POCD的發(fā)病機(jī)制逐漸傾向于麻醉劑促使中樞神經(jīng)炎性反應(yīng)激活，對中樞神經(jīng)產(chǎn)生一定的神經(jīng)毒性而出現(xiàn)認(rèn)知受損。Sonic Hedgehog（Shh）信號通路在海馬神經(jīng)發(fā)生發(fā)育中占據(jù)重要位置，近年來有研究[6-7]顯示成年大鼠受到炎性刺激后腦組織Shh被激活，更有研究人員[8]認(rèn)為腦組織Shh信號激活具有炎性反應(yīng)依賴性。

針灸是中醫(yī)學(xué)的重要組分，大量資料顯示刺激特定穴位可明顯改善認(rèn)知功能。百會穴位于機(jī)體巔頂，是三陽五會之穴;印堂穴位于額葉，解剖學(xué)顯示印堂穴所在皮下分布大量的末梢神經(jīng)。本團(tuán)隊(duì)在前期研究證實(shí)刺激百會穴、印堂穴對POCD療效確切，但其作用機(jī)制不清，故本研究利用動物模型進(jìn)一步探析百會穴、印堂穴治療POCD的作用機(jī)制，具體如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?30只SPF級SD大鼠，均購自長沙市天勤生物有限公司;許可證號為scxk（湘）2014-0010，scxk（湘）2014-0011。體質(zhì)量550～600 g，平均體質(zhì)量（575±5.84）g，鼠齡16～18個(gè)月，平均鼠齡（17±0.35）個(gè)月。

1.1.2?儀器與試劑?Morris水迷宮（江蘇賽昂斯公司）;Shh一抗抗體（Abcam公司，ab19897）、Gli一抗抗體（Abcam公司，ab151796）、PI3K一抗抗體（Abcam公司，ab129182）、p-AKT一抗抗體（Abcam公司，ab129402）;Model68酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad Laboratories）;七氟醚（山東魯南貝特制藥有限公司，批號：65170507）;Vamos氣體檢測儀（德國Draeger公司）;針具（華佗牌0.3 mm×25 mm）;SDS配膠試劑盒（碧云天生物公司）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

1.2.1.1?分組?將30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為空白組、麻醉組及電針組，每組10只。3組大鼠在鼠齡、體質(zhì)量、飼養(yǎng)環(huán)境等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2.1.2?POCD模型制備

1）空白組處理方法：僅將空白組大鼠置于麻醉箱內(nèi)，持續(xù)吸入純氧3 h，隨后返回飼養(yǎng)籠內(nèi)，安靜情況下飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。

2）麻醉組及電針組處理方法：依據(jù)參考文獻(xiàn)[9]中的方法建立POCD模型，將麻醉組及電針組大鼠置于鋼化麻醉箱（70 cm×50 cm×40 cm）中，麻醉箱設(shè)置2個(gè)端口，一個(gè)端口接入麻醉機(jī)，另一個(gè)端口接入氧氣管，隨后麻醉機(jī)釋放七氟醚，同時(shí)使用Vamos氣體檢測儀對麻醉箱內(nèi)七氟醚濃度進(jìn)行檢測，使其保持濃度3.0%，持續(xù)吸入30 min，隨后用1.5%七氟醚麻醉及2 L/min氧氣流量維持3 h。隨后吸入純氧10 min，待大鼠清醒后返回飼養(yǎng)籠內(nèi)，安靜情況下飼養(yǎng)。

1.2.2?干預(yù)方法?電針組大鼠針刺百會穴、印堂穴，取穴位置參照參照李忠仁主編[10]的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，針刺深度為3 mm，每10 min行針1次，留針30 min，1次/d，連續(xù)治療14 d。空白組和麻醉組均未治療，針刺干預(yù)者對動物分組不知情。

1.2.3?觀察指標(biāo)與方法

1.2.3.1?行為學(xué)檢測

1）Morris水迷宮測試：將水迷宮設(shè)置為4個(gè)象限，分別是第一象限、第二象限、第三象限及第四象限。將平臺放在西南象限（第三象限）正中距池壁22 cm處，迷宮中清水平面高于安全平臺1 cm，水溫（22±0.5）℃，室溫25 ℃，訓(xùn)練期間保持環(huán)境安靜，迷宮外參照物不變，并在計(jì)算機(jī)軟件中標(biāo)記平臺位置，隨后將大鼠分別從一、二、三、四個(gè)象限的順序放入水中，記錄大鼠尋找到平臺的時(shí)間，設(shè)置為逃避潛伏期，同時(shí)記錄大鼠尋找到平臺的總路程。造模前對所有大鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練2 d，4次/d。

2）定位航行實(shí)驗(yàn)：測量大鼠對學(xué)習(xí)記憶的獲取能力。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，受試動物每天分別從東北、西北2個(gè)象限入水點(diǎn)依次進(jìn)行訓(xùn)練，將大鼠面向池壁放入水中，記錄其逃避潛伏期（從入水至找到安全平臺的時(shí)間），測試時(shí)間限定為60 s，超過者以60 s計(jì)。

3）空間探索實(shí)驗(yàn)：完成定位航行實(shí)驗(yàn)步驟后將平臺撤離，從4個(gè)象限中挑選任意一象限作為固定入水點(diǎn)，大鼠面向池壁放入池中，記錄大鼠在60 s內(nèi)穿越原先平臺位置的次數(shù)。

1.2.3.2?HE染色觀察海馬病理結(jié)構(gòu)改變?干預(yù)結(jié)束后從各組隨機(jī)選取3只大鼠，充分麻醉后灌流4%多聚甲醛溶液，隨后快速取出腦組織后分離出海馬，并隨機(jī)置于4%多聚甲醛溶液中。將標(biāo)本置于包埋盒中，用流水充分去除固定液，持續(xù)30 min。用100%乙醇10 min→95%乙醇，5 min→80%乙醇5 min進(jìn)行脫水后將樣本置于二甲苯中透明，將已透明的樣本置于已溶化的石蠟中進(jìn)行包埋，將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成薄片5 μm薄片，撈片至載玻片后放置于45 ℃恒溫箱中烘干。染色前將石蠟切片脫蠟至水，用蘇木素染色5 min后流動水沖洗1 min，再用1%鹽酸乙醇分化1 min，再用流動水沖洗15 min后進(jìn)行反藍(lán)30 min，繼續(xù)用流動水沖洗15 min后將樣本玻片置于0.5%伊紅水溶液中復(fù)染2 min，在進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片，隨后將玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3.3?Western blotting檢測海馬組織Shh、Gli、PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平的變化?從各組中隨機(jī)抓取3只大鼠，充分麻醉后取出海馬組織，切割成約100 mg，加入1 mLRAPI裂解液，室溫條件下靜置30 min，4 ℃、15 000 r/min條件下離心5 min，取上清備用。取出25 μL進(jìn)行BCA法測定樣本蛋白濃度，根據(jù)樣本上樣緩沖液=4∶1的比例進(jìn)行均勻混合后將每份待測置于100 ℃水浴鍋中加熱變性7 min，變性后迅速將樣本放于冰上冷卻，保存于-20 ℃冰箱備用。隨后根據(jù)計(jì)算得出的上樣量加樣至先前配制好的SDS-PAGE凝膠孔中，進(jìn)行跑膠，將目的蛋白轉(zhuǎn)膜只PVDF膜，再用封閉液對PVDF膜進(jìn)行封閉，封閉后將PVDF膜置于TBS中漂洗3次，5 min/次，隨后用一抗稀釋液按照1∶500的比例稀釋β-actin、Shh、Gli、PI3K、p-AKT，4 ℃孵育過夜后置于TBS中漂洗3次，5 min/次，然后加入堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（二抗稀釋液1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h，再用TBS漂洗3次，5 min/次。結(jié)束后在PVDF膜上滴入ECL顯影液顯影、拍照，用計(jì)算機(jī)掃描圖像，并由Bio-Rad Image軟件（Bio-Rad公司，Model Gel Doc 2000，美國）分析處理。

1.2.3.4?Real-Time PCR法檢測海馬組織Shh、Gli、PI3K、p-AKTmRNA表達(dá)水平的變化?從各組中隨機(jī)抓取3只大鼠，充分麻醉后取出海馬組織，切割成約100 mg，加入1 mLTrizol，冰上靜置5 min后加入200 μL氯仿粉后充分混勻，冰上靜置5 min后置于4 ℃，15 000 r/min條件下離心10 min，摒棄上清液，20 μL DEPC水，根據(jù)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄過程如下：95 ℃（6 min）→55 ℃（90 s）→72 ℃ 90 s）→72 ℃（10 min）→5 ℃（1 h）。以GAPDH為內(nèi)部參照，利用ABI7500軟件得出（Ctcycle threshold）值，空白組△Ct值作為校正數(shù)值，軟件根據(jù)2-△△Ct數(shù)值計(jì)算得出Shh、Gli、Ptch1mRNA濃度水平。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法?采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，3組數(shù)據(jù)同時(shí)符合正態(tài)分布和方差齊性則采用單因素方差分析，若其中一組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用多組秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?3組行為學(xué)變化?麻醉組及電針組大鼠游泳軌跡和逃避潛伏期較空白組延長（P<0.05），穿越平臺次數(shù)減少（P<0.05），其中電針組明顯較麻醉組改善（P<0.05）。見表1及圖1。

2.2?3組HE染色結(jié)果比較?HE染色提示空白組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，麻醉組及電針組大鼠海馬組織均出現(xiàn)明顯結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞排列錯亂，神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯變形縮小，其中電針組海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)較麻醉組改善。見圖2。

2.3?3組海馬組織Shh、Gli達(dá)水平的變化?Western blot及PT-PCR的結(jié)果顯示，麻醉組及電針組大鼠海馬組織Shh、Gli、PI3K、p-AKT蛋白及mRNA表達(dá)較空白組降低（P<0.05），其中電針組較麻醉組改善（P<0.05）。見圖3及表2、表3。

3?討論

POCD具有一過性，是手術(shù)麻醉后出現(xiàn)的輕度的神經(jīng)功能紊亂綜合征[11]，常發(fā)生于老年患者，主要以學(xué)習(xí)力、記憶力受損、執(zhí)行力及注意力減弱為表現(xiàn)，其中學(xué)習(xí)記憶能力受損是POCD的核心癥狀，可在各年齡層患者發(fā)病。有研究人員[3]對1 064例不同年齡層的手術(shù)患者進(jìn)行觀察，在術(shù)后3個(gè)月隨訪時(shí)發(fā)現(xiàn)18～39歲年齡層有5.7%患者出現(xiàn)POCD，而60歲以上人群有12.7%出現(xiàn)POCD，且POCD的老年患者出現(xiàn)后3個(gè)月內(nèi)的死亡率明顯增加。由此對POCD進(jìn)行積極預(yù)防與治療具有重要臨床意義。

臨床實(shí)踐證實(shí)刺激特定的穴位在防治POCD方面有重要療效，有團(tuán)隊(duì)[12]以“健忘””呆病”“遺忘”“不識人”“恍惚”“忘前失後”“善忘”“怔忡”為術(shù)語對學(xué)習(xí)記憶障礙古籍進(jìn)行梳理，結(jié)果顯示百會穴是使用頻次最高的穴位（31次），印堂穴（10次）?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》曰：“陽氣者，精則養(yǎng)神，柔則養(yǎng)筋”，認(rèn)知為神，形以衡為代表，督脈乃陽脈之海，百會穴別名“三陽五會”，《針灸甲乙經(jīng)》云：“百會為督脈，足太陽之會”，《類經(jīng)圖翼》描述：“百會為督脈，足太陽、手足少陽和足厥陰之會”，以上均揭示百會穴是治療神志疾病的要穴。印堂穴亦為督脈的要穴，有醒腦開竅、安神活絡(luò)的作用?！峨y經(jīng)·二十八難》云：“督脈者，起于下極之輸，并于脊里，上至風(fēng)府，入屬于腦”[13-16]。由此可見，刺激督脈可養(yǎng)神充髓。本研究利用七氟醚制備POCD模型，用水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示POCD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯較正常大鼠明顯減退，且在研究中用HE染色發(fā)現(xiàn)POCD大鼠海馬區(qū)出現(xiàn)明顯結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞排列錯亂，神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯變形縮小，提示POCD與海馬結(jié)構(gòu)受損關(guān)系密切。同時(shí)，刺激百會穴、印堂穴后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，且海馬的病理結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一定程度的修復(fù)，提示百會穴、印堂穴改善POCD模型鼠學(xué)習(xí)記憶能力與修復(fù)海馬病理結(jié)構(gòu)有關(guān)。

Sonic Hedgehog（Shh）信號通路與神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系密切，近年來該通路與神經(jīng)細(xì)胞炎性反應(yīng)的關(guān)系備受關(guān)注[17]。Patched（ptc）和Smoothed（Smo）2種受體共同調(diào)控Shh通路的信號傳遞，Ptc受體與配體結(jié)合后對Shh信號通路產(chǎn)生負(fù)調(diào)控效應(yīng)，而Smo對Shh通路的調(diào)控需在無Ptch的條件下進(jìn)行，Smo被激活后介導(dǎo)Shh通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子Gli的活性，從而活化PI3K/AKt信號通路，從而減輕炎性反應(yīng)[18-20]。利用Western blot及Real-Time PCR顯示POCD海馬組織Shh、Gli、PI3K、p-AKT蛋白及mRNA表達(dá)均明顯下降，提示Shh信號通路參與了POCD的發(fā)生發(fā)展過程，而百會穴、印堂穴改善POCD模型鼠學(xué)習(xí)記憶能力可能是通過激活Shh通路實(shí)現(xiàn)的。

由此可以認(rèn)為，七氟醚可對大鼠造成一過性認(rèn)知障礙，百會穴、印堂穴改善POCD模型鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制可能與激活Shh信號通路有關(guān)。

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（2019-03-21收稿?責(zé)任編輯：芮莉莉）