劉春潔 王兆琛 杜 煒 趙勇超 張家新

(內蒙古農業(yè)大學 動物科學學院/內蒙古自治區(qū)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，呼和浩特 010018)

哺乳動物卵泡發(fā)育過程中，超過99%的卵泡會發(fā)生閉鎖，卵泡閉鎖是卵巢卵泡發(fā)育、成熟、排卵過程中重要的生理過程。如果這一過程不能正常進行，往往會導致雌性動物多囊卵巢綜合征和卵巢早衰，甚至不孕不育[1-2]。已有研究表明卵泡閉鎖與GCs凋亡密切相關，主要體現(xiàn)DNA碎片化和促凋亡基因表達顯著上調[3]。卵泡發(fā)育是一個相對復雜的過程，主要受促性腺激素的調控[2,4]。其中促卵泡素(FSH)作為卵泡生長、發(fā)育和優(yōu)勢卵泡選擇的一種重要的促性腺激素，同時還具有促進GCs增殖分化的功能[5-7]。這一過程是通過激活GCs的多個信號級聯(lián)引起FSH生理機制應答，包括蛋白激酶A(PKA)，蛋白激酶B(PKB/AKT)，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)和細胞外信號調節(jié)激酶1和2(ERK1/2)[8]。

在小鼠細胞研究中發(fā)現(xiàn)，通過減緩FOXO1轉錄抑制可以影響細胞中細胞周期蛋白(Ccnd-2)的表達[9]。研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠Ccnd-2基因后，細胞增殖被阻滯[9]。FOXO1的轉錄抑制也可以影響細胞核抗原(PCNA)基因的表達，PCNA是一種與增殖相關蛋白DNA合成有關的基因，起初表達于初級卵泡的GCs，在FSH作用下其表達量增加[10-11]。Bcl-2作為抗細胞凋亡家族蛋白，定位于線粒體膜，參與GCs的凋亡，其作用機制同樣受到FOXO1轉錄調控[12]。FOXO1基因具有調節(jié)細胞凋亡，細胞周期停滯，細胞穩(wěn)態(tài)等功能[9]。由于FOXO1結合DNA，抑制或激活靶基因特異性轉錄[13]。而FOXO1結合DNA能力主要受AKT磷酸化作用，當未發(fā)生磷酸化時，F(xiàn)OXO1定位于細胞核，通過與其靶基因結合到FOXO1識別元件(FRE)上，發(fā)揮生物學活性[13-14]。

FOXO1是FSH信號通路的靶分子，受FSH的負調控。FSH通過PKB/AKT通路引起FOXO1的磷酸化失活，從而失去對靶基因的轉錄調節(jié)作用[15]。因此，F(xiàn)SH維持卵泡生長發(fā)育的功能可能與FSH對FOXO1的抑制有關。其在GCs上發(fā)揮的潛在機制仍有待進一步探究。關于FSH通過AKT/FOXO1通路調控卵泡顆粒細胞增殖的研究大多數(shù)是針對小鼠等試驗動物，在家畜上研究較少，因此，本試驗擬用綿羊卵巢GCs，對綿羊GCs用不同濃度FSH處理后，利用CCK-8法檢測細胞活性，AnnexinV-FITC測定細胞凋亡和細胞周期變化，Western-Blot檢測p-AKT和p-FOXO1蛋白質表達；qPCR分析PCNA、CCnd-2和Bcl-2基因表達量變化，以期探究FSH通過AKT/FOXO1信號通路對綿羊GCs的調節(jié)作用，為提高母畜繁殖性能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本地屠宰場獲得綿羊(24～36 月齡，體重平均83 kg)卵巢，去掉系膜等殘余組織，使用37 ℃生理鹽水洗滌3次，置含有預熱37 ℃生理鹽水保溫杯內，并于2～3 h內送至實驗室，然后再預熱37 ℃，添加青鏈霉素合劑的生理鹽水洗滌卵巢3遍，將卵巢放于預熱的滅菌生理鹽水，置37 ℃水浴鍋，待用。

1.2 試驗試劑

促卵泡激素FSH(Bioniche，加拿大)； DMEM/F 12培養(yǎng)基(Gibco，美國)；胎牛血清(HyClone，美國)；電轉液購自(Biosharp，中國)；0.45 μm PVDF膜(Millipore，美國)；AKT 磷酸化抗體、FOXO1磷酸化抗體、β-actin抗體、AKT抑制劑AT7867(MCE，美國)；HRP標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗鼠IgG、蛋白Marker、ECL底物液、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，美國)；Annexin-FITC/PI(Vazyme，美國)；CCK-8(Beyotime Biotechnology，中國)。

1.3 試驗方法

1.3.1GCs收集

在超凈臺內用眼科剪將卵巢上的卵泡小心分離，用PBS盡可能將卵泡周圍的組織清洗干凈。收集直徑4～6 mm大小卵泡。在盛有PBS的凹形皿內，用眼科剪將卵泡輕輕剪開，用刮刀沿卵泡內壁適度刮取細胞，置于含青霉素鏈霉素的PBS液中，并清洗3次，然后用添加0.3%牛血清白蛋白，3%胎牛血清，1 %青鏈霉素合劑的DMEM/F 12培養(yǎng)基重懸細胞，PI染色計數(shù)，調整細胞密度為5×105個/mL，轉移到1.5 mL的離心管內，1 400 r/min 離心5 min后棄上清，立即將細胞投入液氮，后放入 -80 ℃ 冰箱保存，用于后續(xù)RNA提取。

1.3.2不同濃度FSH和抑制劑AT7867對GCs增殖影響

將分離純化的綿羊顆粒細胞按相同濃度接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔細胞進行隨機分組進行后續(xù)試驗。試驗一將分組的每孔細胞分別添加0、5、10和20 ng/ mL FSH。培養(yǎng)24 h后，采用CCK-8法對不同時間檢測細胞活性。觀察FSH對綿羊卵巢GCs活性的影響。每組數(shù)據(jù)重復3 次以上。試驗二將分組的每孔細胞分別添加0、5、10、20和40 μmol/L抑制劑AT7867，試驗方法同試驗一。觀察抑制劑AT7867對卵巢GCs培養(yǎng)的影響。每組試驗各重復3 次以上。

1.3.3GCs周期檢測

培養(yǎng)24 h獲得細胞，用不含EDTA的胰蛋白酶室溫消化15～20 min，消化后經PBS清洗2～3次，1 400 r/min，離心5 min后，收集細胞沉淀后用70%預冷乙醇固定24 h左右。然后收集不同處理后固定的細胞樣本，經PBS洗滌2～3次后，根據(jù)細胞周期試劑盒測定不同處理樣本，每個樣本添加100 μL Rnase酶吹打均勻后，37 ℃處理30 min，然后各孔添加400 μL PI染液，4 ℃避光孵育30 min，使用流式儀細胞檢測細胞周期。

1.3.4GCs凋亡檢測

將待檢測細胞從培養(yǎng)箱取出，然后用預冷PBS清洗細胞2～3次；各孔加500 μL不含EDTA的胰蛋白酶，室溫消化，待細胞完全脫落，用移液槍輕輕吹打使細胞分散；將所吸出EP管中培養(yǎng)液加到對應各孔細胞內，終止胰蛋白酶消化；然后將細胞懸液轉入5 mL EP管內，1 400 r/min，離心5 min，棄上清，用1 mL PBS輕輕吹起沉淀細胞，洗滌2～3次，1 400 r/min，離心5 min后棄上清；按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書，每個樣本加入500 μL結合緩沖液重懸細胞，然后加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，室溫避光(錫箔紙)孵育10～30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.5qPCR檢測GCs中基因表達

采用TRNzol法提取組織樣品總RNA，使用NanoDropTMND-2000測定RNA濃度和純度。要求A260/280介于1.8～2.1， 28S:18S)≥1.8∶1.0，濃度≥200 ng/uL。采用qRT-PCR技術定量分析PCNA、CCnd-2和Bcl-2基因在不同培養(yǎng)條件下獲得顆粒細胞中的表達水平。采用Oligo 6.0軟件設計qPCR并合成引物(表1)。分別采用Prime ScriptTMRT試劑盒和SYBY Premix ExTaqTM試劑盒(TaKaRa，日本)進行cDNA逆轉錄和qPCR反應，所有操作嚴格按照試劑盒說明書于IQ-5熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)上進行。qPCR反應體系為25 μL，包括12.5 μL SYBR Premix Ex Taq TM(2a)、1 μL上游引物、1 μL下游引物、2.0 μL cDNA模板和8.5 μL ddH2O。反應程序：預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 15 s，45個循環(huán)，延伸階段收集熒光信號，70～95 ℃繪制溶解曲線。采用β-actin作為內參基因，每組數(shù)據(jù)重復3次以上。

表1 qPCR引物Table 1 Primers of qPCR

1.3.6Western blotting 法檢測蛋白表達

準備進行SDS-PAGE的5%濃縮膠和12%分離膠。樣品經緩沖液變性處理，上樣，每孔20 μg。濕轉膜法完成后經染色劑對膜進行染色并鑒定轉膜效果。將轉膜良好的膜完全浸沒5%脫脂奶粉-TBST液中，室溫輕搖封閉30 min，后用5%脫脂奶粉-TBST按1∶1 000稀釋p-AKT和p-FOXO1抗體，室溫震搖10 min，充分混勻抗體，置搖床震搖過夜。第2天使用TBST洗膜5次，每次5 min，用5%脫脂奶粉-TBST按1∶1 000 稀釋二抗IgG，室溫輕搖40 min，TBST洗膜6次，每次5 min，ECL孵育，最后化學發(fā)光成像儀成像。

1.3.7數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCT公式計算qRT-PCR結果，利用SPASS統(tǒng)計軟件T-test進行差異顯著性檢驗，數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SEM)表示。每組試驗數(shù)據(jù)重復至少3次。

2 結果與分析

2.1 FSH對GCs活性影響

在綿羊GCs培養(yǎng)基中添加濃度分別為0、5、10、20和40 ng/mL的FSH進行培養(yǎng)。每間隔1 d記錄GCs增殖情況，接種當天記錄0 d，及接種后1～6 d,結果見圖1。10 ng/mL FSH培養(yǎng)GCs活性極顯著高于其他處理組(P<0.01)。進一步證明FSH能顯著提高GCs的增殖能力。

**表示差異極顯著P<0.01。**indicates extremely significant difference (P<0.01).圖1 不同濃度促卵泡素對體外顆粒細胞活性影響Fig.1 Effect of different concentrations of FSH on the GCs viability in vitro

2.2 FSH對GCs凋亡影響

將GCs接種6孔板培養(yǎng)24 h后，利用Annexin V-FITC/PI熒光染色。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結果見圖2：在10 ng/mL FSH培養(yǎng)下，GCs凋亡率極顯著低于其他濃度FSH培養(yǎng)的GCs(P<0.01)。這一結果說明10 ng/mL FSH對綿羊GCs增殖有明顯地促進作用，同時能顯著抑制綿羊GCs凋亡。

*表示差異顯著P<0.05；**表示差異極顯著P<0.01。*indicates significant difference (P<0.05). **indicates extremely significant difference(P<0.01).圖2 不同濃度促卵泡素對體外顆粒細胞凋亡影響Fig.2 Effect of different concentrations FSH on the apoptosis of the GCs in vitro

2.3 FSH對GCs周期的影響

分別將不同濃度FSH添加培養(yǎng)基中培養(yǎng)GCs 24 h后，使用PI染色檢測細胞周期。由圖3可見：添加10 ng/mL FSH后，細胞從 G1期到 S期過渡時期，細胞增殖數(shù)量出現(xiàn)顯著提高(P<0.05)。由于GCs增殖速度和數(shù)量發(fā)生變化主要發(fā)生于細胞周期G1到S階段過渡中。這一過程主要受卵巢內分泌因子與調節(jié)因子之間的相互作用，用以調節(jié)卵泡顆粒細胞增殖和分化。

不同字母表示差異顯著P<0.05。Different letters indicate significant differences between groups (P<0.05).圖3 不同濃度促卵泡素對體外綿羊顆粒細胞周期影響Fig.3 Effect of different concentrations FSH on the GCs cell cycle in vitro

2.4 抑制劑AT7867對GCs活性影響

使用AKT/FOXO1通路的抑制劑AT7867預處理GCs，根據(jù)抑制劑的不同濃度(0、 5、10、20和40 μmol/L)和不同時間(0、4、8、12、16、18、24、26 和28 h)測定GCs活性。結果表明10 μmol/L AT7867抑制劑孵育24 h，GCs活性極顯著低于其他處理組(P<0.01)(圖4)。抑制劑AT7867可阻斷AKT發(fā)生磷酸化，進一步影響AKT信號通路下游靶基因FOXO1的轉錄水平，最終阻滯GCs增殖分化功能。

2.5 FSH通過AKT/FOXO1信號通路上調PCNA、Ccnd-2和Bcl-2

組1是GCs僅用培養(yǎng)基DMEM/F 12為對照組，組2為添加10 ng/mL FSH,組別3為添加10 μmol/L AT7867抑制劑，組別4是同時10 ng/mL FSH和10 μmol/L AT7867抑制劑，孵育24 h后,通過Wester-Blot檢測，如圖5(a)～(b)所示，與其他處理組相比，10 ng/mL FSH(4(a2))顯著提高p-AKT(S473)蛋白的表達，降低p-FOXO1蛋白水平(4(b2))，同時上調綿羊GCs中PCNA、Ccnd-2和Bcl-2基因。如圖5(c)～(e)。PCNA、Ccnd-2和Bcl-2是通過AKT/FOXO1信號通路參與細胞增殖，抑制細胞發(fā)生凋亡的生物學過程。

圖4 不同濃度抑制劑AT7867對體外顆粒細胞活性影響Fig.4 Effect of different concentrations inhibitor AT7867 on the GCs viability in vitro

1：對照組；2：促卵泡素；3抑制劑AT7867；4：促卵泡素加抑制劑. **表示差異極顯著P<0.01。1：Control； 2：FSH； 3：Inhibitor AT7867； 4：FSH+AT7867.**indicates extremely significant difference (P<0.01).圖5 FSH通過AKT/FOXO1通路上調靶基因Fig.5 FSH up-regulate targeted genes by AKT/FOXO1 pathway

3 討論與結論

哺乳動物卵巢卵泡的發(fā)育主要受垂體分泌的促性腺素調控。其中FSH是卵泡發(fā)育過程中形成優(yōu)勢卵泡的主導激素[16]。FSH通過靶器官細胞膜上的特異性受體FSHR介導，影響卵泡發(fā)育的成熟和卵泡數(shù)量。FSHR主要表達卵巢卵泡GCs，其表達水平與GCs存活、卵泡閉鎖和卵母細胞成熟密切相關[17]。本試驗通過添加不同濃度FSH對綿羊GCs進行24 h培養(yǎng)后，檢測其細胞活性和凋亡，發(fā)現(xiàn)10 ng/mL FSH對綿羊GCs增殖有明顯的促進作用，同時能顯著減少綿羊GCs凋亡(圖1和圖2)。已有研究表明卵泡發(fā)育和閉鎖調節(jié)是一個復雜的過程，涉及內分泌因子與卵巢調節(jié)因子之間的相互作用，從而控制卵泡細胞的命運(細胞增殖、分化和細胞程序性死亡)[18]。本試驗中添加10 ng/mL FSH處理24 h后，檢測到細胞從 G1期到 S期，發(fā)現(xiàn)細胞增殖數(shù)量出現(xiàn)顯著提高。這與已有研究報道GCs增殖速度和數(shù)量發(fā)生變化主要發(fā)生于細胞周期G1到S階段過渡中的結果一致[19-20]。

已有研究表明FSH下游的轉錄因子PCNA、Ccnd-2和BCl-2的特異性表達水平，主要受FOXO1調控[15-18]；而FOXO1主要受AKT磷酸化調控，由PI3K途徑激活，調節(jié)細胞周期、代謝或存活[21-22]。其中：PCNA是真核細胞DNA合成時所必需的一種細胞核蛋白，在細胞核內合成，并儲存核內。PCNA在細胞分裂期出現(xiàn)，其表達量的變化與DNA合成一致，與多種細胞周期調節(jié)因子和細胞增殖密切相關[16]。而Ccnd-2是參與調控細胞周期中G1期向S期過渡的重要蛋白[17]。Bcl-2作為G1/S期過渡階段的重要的調控蛋白，一方面能夠促進細胞增殖，抑制細胞發(fā)生凋亡；另一方面可以調節(jié)細胞氧化還原狀態(tài)(非蛋白巰基、谷胱甘肽)，增強細胞抗氧化能力，減輕由氧化應激引起的細胞早期凋亡[23]。

在大鼠GCs的試驗中證實，抑制FOXO1磷酸化水平，能增強細胞中PCNA和Ccnd-2基因的特異性表達水平，進而阻滯細胞發(fā)生凋亡[15]。進一步在大鼠腎小球系膜細胞的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1過表達會促使抗凋亡因子Bcl-2下調，導致細胞周期停滯，降低細胞增殖能力[24]。阻斷AKT下游的FOXO1蛋白質的磷酸化水平，則導致下游靶基因的功能發(fā)生改變[25]

本研究結果表明： 10 ng/mLFSH處理能顯著升高GCs中p-AKT蛋白水平和顯著降低p-FOXO1的表達量，顯著上調PCNA、CCnd-2和Bcl-2的轉錄水平；并能顯著增強綿羊GCs活性和顯著減少綿羊GCs凋亡。FSH通過AKT/FOXO1信號通路調控靶基因PCNA、CCnd-2和Bcl-2轉錄水平，本研究可為進一步探明綿羊GCs功能的分子機制研究奠定基礎。