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膽固醇敏感器SCAP超表達(dá)引發(fā)人類腎系膜細(xì)胞的脂質(zhì)聚集

2020-04-18 07:45王媛媛曲婷婷胡紅霞常潔
關(guān)鍵詞:脂質(zhì)膽固醇腎臟

王媛媛,曲婷婷,胡紅霞,常潔

(1河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院,2河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院,河南 洛陽 471000)

早在1982年時(shí),Moorhead就首次提出脂質(zhì)具有腎毒性,在隨后的一系列研究中發(fā)現(xiàn),脂質(zhì)代謝紊亂是腎臟損害的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[1-2]。腎臟脂質(zhì)的異常沉積會(huì)促進(jìn)腎臟系膜細(xì)胞泡沫樣變,足細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能異常及凋亡增加。激活蛋白(SCAP)是一種多聚膜蛋白,它如同一個(gè)分子機(jī)器,控制著哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜內(nèi)的膽固醇含量。它通過結(jié)合膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)并將他們從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)運(yùn)輸?shù)礁郀柣w進(jìn)行蛋白水解處理,蛋白水解釋放的SREBP轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核,從而促進(jìn)膽固醇的合成和攝取。當(dāng)膽固醇在ER膜上的含量超過一個(gè)閾值,固醇結(jié)合到SCAP,從而觸發(fā)一系列的構(gòu)象變化,從而阻止了SCAP-SREBP復(fù)合物離開ER。因此,SREBPs不再被加工,膽固醇合成和攝取受到抑制,膽固醇的穩(wěn)態(tài)得到恢復(fù)[3-4]。本文旨在研究SCAP超表達(dá)在HMCs中的作用,為進(jìn)一步探討脂代謝紊亂引起相關(guān)腎臟損害的發(fā)生機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人類腎系膜細(xì)胞(HMCs)(重慶醫(yī)科大學(xué));RPMI1640培養(yǎng)基、優(yōu)等胎牛血清(塞默飛世爾化學(xué)制品有限公司);油紅O染色試劑、細(xì)胞內(nèi)膽固醇測(cè)定試劑盒(美國SIGMA);蛋白提取試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司);質(zhì)粒抽提試劑Plasmid Mini KitⅠ(OMEGA公司);轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司);DNeasy Blood&Tissure Kit(美國QIAGEN公司);兔源抗SCAP多克隆抗體、兔源抗β-actin多克隆抗體、羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(美國santa cluz);引物合成(生工生物工程);血漿低密度脂蛋白(LDL)(來自健康志愿者血清)。

1.2 方法(1)細(xì)胞培養(yǎng):HMCs含5%優(yōu)等胎牛血清、5 μg/ml胰島素,5 μg/ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白,5 ng/ml亞硒酸鈉(Sigma),100 U/ml青霉素,100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,于20%O2、5%CO2、75%N2的恒溫孵箱中37℃培養(yǎng)。(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染:采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000,按照試劑說明,按照 DNA(ug):脂質(zhì)體(ul)為1∶2的比例轉(zhuǎn)染[5]。(3)LDL及oxLDL的制備和電泳[6]:取健康志愿者新鮮血漿,采用密度梯度超速離心法提取脂蛋白。將提取的LDL于4℃PBS中透析24小時(shí);純化后LDL與5 mol/L硫酸銅于37℃孵育18小時(shí)獲得oxLDL。(4)油紅O染色:將轉(zhuǎn)染后的觀察組和對(duì)照組HMCs細(xì)胞,分別用含和不含LDL干預(yù)條件的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)處理24小時(shí)后,4%多聚甲醛固定30 min,PBS清洗,1,2-丙二醇孵育2 min后加入0.2%油紅O染液染15 min,蘇木精染核,甘油明膠封片,正置顯微鏡高倍視野(×400)下觀察拍照。(5)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的測(cè)定:收集各組細(xì)胞懸液,離心后去除上清,加入氯仿/甲醇2∶1溶液混勻,超聲震碎后搖床室溫震蕩15 min,9000 rpm高速離心,取上清液真空干燥后溶于95%乙醇,測(cè)量細(xì)胞內(nèi)總膽固醇的含量。離心后白色沉淀物中加入1M NaOH溶解沉淀12小時(shí),然后使用Lowry法做蛋白的均一化分析。(6)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定和Western blot分析:不同干預(yù)條件的觀察組細(xì)胞,分別提取總RNA和蛋白,檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄后的LDLr,SCAP,HMGCoA的mRNA 表達(dá)水平和SCAP、SREBP-2、HMGCoA和β-actin蛋白表達(dá)水平。PCR引物見表1。

表1 PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示,組間比較采用t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SCAP超表達(dá)于HMCs后的油紅O染色結(jié)果 見圖1。油紅O染色用來檢測(cè)HMCs細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)(膽固醇酯)的聚集情況。結(jié)果顯示,當(dāng)培養(yǎng)基不含LDL時(shí),對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)未見明顯脂滴(Ⅰ),SCAP超表達(dá)細(xì)胞內(nèi)可見少量紅染脂滴出現(xiàn)(Ⅱ),說明超表達(dá)促進(jìn)HMCs對(duì)脂質(zhì)的合成;當(dāng)采用200 μg/ml LDL實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯脂滴(Ⅲ),而SCAP超表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)膽固醇的積聚異常增加(Ⅳ)。

圖1 SCAP超表達(dá)于HMCs后的油紅O染色結(jié)果

2.2 SCAP超表達(dá)對(duì)HMCs細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的影響 見圖2。實(shí)驗(yàn)為對(duì)照組和超表達(dá)組HMCs分別在有無LDL培養(yǎng)基培養(yǎng)后的細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量的測(cè)定,在無LDL培養(yǎng)基培養(yǎng)的HMCs細(xì)胞中,SCAP超表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量高于非超表達(dá)組,在200 μg/ml LDL加載的培養(yǎng)基培養(yǎng)的HMCs細(xì)胞中,SCAP超表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量同樣高于非超表達(dá)組。以上數(shù)據(jù)與油紅O染色的結(jié)果相一致。

圖2 SCAP超表達(dá)對(duì)HMCs細(xì)胞內(nèi)總膽固醇水平的影響

2.3 SCAP超表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)LDLr、HMGCoA mRNA和蛋白及細(xì)胞核內(nèi)SREBP2蛋白表達(dá)的影響 見表1,圖3。轉(zhuǎn)染SCAP后SCAP mRNA和蛋白超表達(dá),200 μg/ml的LDL能使非超表達(dá)組的SCAP mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào),而對(duì)SCAP超表達(dá)組細(xì)胞無明顯影響。2.4 LDLr、HMGCoA還原酶mRNA、蛋白及核蛋白SREBP2 N末端(N-SREBP2)蛋白表達(dá) 見圖4。在非SCAP超表達(dá)的HMCs細(xì)胞中,200 μg/ml的LDL使得LDLr mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下調(diào),同樣的LDL處理?xiàng)l件SCAP超表達(dá)細(xì)胞并沒有明顯下調(diào)。在沒有LDL處理?xiàng)l件下,SCAP超表達(dá)組細(xì)胞與非超表達(dá)組比較,LDLr水平有明顯增高。

表1 LDL對(duì)SCAP、mRNA和蛋白表達(dá)的影響

表1 LDL對(duì)SCAP、mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Groups Control Control+LDL SCAP-over+LDL SCAP-over SCAPmRNAlevel(mean±SD) 1 0.09±0.02* 21964.5±8430.34** 57875.9±17825.7*

圖3 LDL對(duì)HMCs細(xì)胞內(nèi)SCAP mRNA和蛋白水平的影響

圖4 LDL對(duì)HMCs細(xì)胞內(nèi)LDLr、HMGCoA mRNA和蛋水平及核內(nèi)N-SREBP2蛋白水平的影響

3 討論

實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明,腎臟疾病的進(jìn)展與血脂異常之間存在相關(guān)性,但脂質(zhì)水平與腎臟疾病進(jìn)展之間關(guān)系的潛在病理生理學(xué)機(jī)制尚未完全了解[7]。傳統(tǒng)上認(rèn)為清道夫受體是血脂異常和泡沫細(xì)胞形成的主要途徑,Brown和Goldstein觀察到,LDL受體的活性通過依賴于細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度的反饋系統(tǒng)受到嚴(yán)格的代謝控制,該反饋系統(tǒng)保護(hù)細(xì)胞發(fā)生天然LDL的積累[3]。因此,在生理?xiàng)l件下,天然LDL不能產(chǎn)生富含脂質(zhì)泡沫細(xì)胞。但我們以往的研究表明炎癥介質(zhì)等可誘導(dǎo)SCAP過表達(dá),導(dǎo)致LDL受體表達(dá)失調(diào)[4,8-9]。近年來也有出現(xiàn)SCAP引發(fā)的脂代謝紊亂與炎癥無關(guān)的研究證明[10]。本研究旨在通過破壞SCAP-SREBP介導(dǎo)的LDL受體反饋調(diào)控系統(tǒng),研究單獨(dú)的SCAP的過表達(dá)是否能增加HMCs中未修飾LDL的細(xì)胞內(nèi)積累,為進(jìn)一步探討脂代謝紊亂的其他相關(guān)機(jī)制提供依據(jù)。

在HMCs中,我們檢測(cè)了SCAP和SREBP2的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)易位,這是SCAP過表達(dá)調(diào)控LDLr表達(dá)的兩個(gè)重要分子。近年來,胰島素誘導(dǎo)基因1(Insig I)被認(rèn)為是一種甾醇調(diào)節(jié)的ER保留因子,與ER中的SCAP-SREBP2復(fù)合物相互作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度增加時(shí),insig I與SCAP中的甾醇敏感區(qū)域結(jié)合,阻止SCAP-SREBP2復(fù)合物從ER中退出。研究結(jié)果表明,在低密度脂蛋白濃度下,SCAP過表達(dá)時(shí),SREBP2蛋白、LDL受體蛋白mRNA、HMGCoA蛋白表達(dá)均升高。我們證明SCAP過表達(dá)導(dǎo)致SCAP蛋白在LDL濃度較高的情況下被聚集到高爾基體,這表明SCAP過表達(dá)破壞了ER與高爾基體之間正常的SCAP轉(zhuǎn)運(yùn)。SCAP和SREBP2的增加可能反過來增加SCAP/Insig I的比例,導(dǎo)致SCAP-SREBP2復(fù)合物在SCAP過表達(dá)的ER中逃逸。

近來已經(jīng)有很多研究證實(shí)了VSMCs在泡沫細(xì)胞形成中的重要作用[11]。因此我們也制作了原代培養(yǎng)的VSMCs,再次驗(yàn)證了SCAP過表達(dá)對(duì)該細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示,SCAP超表達(dá)后LDL受體和HMGCoA的表達(dá)增加,以及高濃度的LDL在細(xì)胞中沉積,與HMCs相似。因此,SCAP的功能紊亂可能是引發(fā)腎小球硬化等腎臟疾病的關(guān)鍵因素。

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