楊呂娟 張子俊 張衛(wèi)紅

摘要：擬蛹螺屬（Pseudonapaeus）種類多為農(nóng)牧業(yè)的害蟲，不僅危害各種蔬菜、花卉，其中某些種類還是家畜、家禽雙腔科吸蟲的中間宿主。本研究主要探究該屬形態(tài)相似2種蝸牛的形態(tài)解剖學和分子生物學特征，確定它們分類，為該類動物的防治和系統(tǒng)分類學研究提供數(shù)據(jù)基礎。形態(tài)結果顯示，2種蝸牛的生境，貝殼質(zhì)地、大小和顏色，齒舌以及顎片的形態(tài)結構相似;但貝殼形狀、殼口齒數(shù)、生殖系統(tǒng)的解剖特征等存在顯著差異。其中，一種為鉆擬蛹螺Pseudonapaeus miser（Martens，1874），另一種為新種，即吐爾根擬蛹螺Pseudonapaeus tuegenensis sp. nov.。分子結果顯示：（1）基于COⅠ基因序列（651 bp）構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，新種和鉆擬蛹螺以高支持率（后驗概率96%）形成一個單系（支系A），顯示二者有密切的親緣關系，但是鉆擬蛹螺3個個體以高支持率（后驗概率100%）聚為一支，與新種產(chǎn)生分異;（2）基于ITS1基因序列（610 bp），新種與鉆擬蛹螺之間的遺傳距離為13.7%（12.5%～15.1%）（與本屬其他種間的遺傳距離更大），顯著高于種內(nèi)遺傳距離2.5%（1.3%～3.5%）。結合COⅠ基因系統(tǒng)發(fā)育樹的結果，支持二者為不同種。分子分析的結果支持比較形態(tài)學的結果，確定吐爾根擬蛹螺P.tuegenensis sp. nov.不同于鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）為一新種，利用分子系統(tǒng)學方法研究該屬的分類問題在國內(nèi)為首次。

關鍵詞：擬蛹螺屬;形態(tài)解剖;COⅠ基因;ITS1;新種;新疆

中圖分類號：S433.89?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0121-06

收稿日期：2018-11-17

基金項目：國家自然科學基金（編號：31260506）。

作者簡介：楊呂娟（1992—），女，四川遂寧人，碩士，主要從事貝類學研究。E-mail：YLJ687592@163.com。

通信作者：張衛(wèi)紅，碩士，副教授，主要從事貝類學研究。E-mail：zwh6879a@163.com。

擬蛹螺屬（Pseudonapaeus）由Westerlund于1887年建立，隸屬于腹足綱（Gastropoda）柄眼目（Stylommatophora）艾納螺科（Enidae）。該屬的多數(shù)種類是農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的害蟲，常危害各種蔬菜、花卉的幼芽、嫩葉等，其中某些種類為家畜、家禽及野生動物雙腔科吸蟲的中間宿主[1-2]。陳德牛等報道雙腔吸蟲病在新疆牧區(qū)廣為流行，大大影響家畜的體膘和產(chǎn)毛量，甚至引起牲畜死亡，其中間宿主為某些陸生螺類（包括艾納螺科的一些種類）[3]。

擬蛹螺屬地理分布較窄，主要分布于中亞以及印度半島西北部，現(xiàn)記載有40余種[4]。我國對該屬的研究相對不足，到目前為止僅報道一種，即鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）。該種在國外分布于塔吉克斯坦、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、俄羅斯、土耳其等地區(qū)，在我國僅在新疆阿勒泰、木壘、庫爾勒、烏什、阿克蘇及天山一帶農(nóng)田和牧區(qū)有分布[5-8]。本研究采用比較形態(tài)解剖學和分子分析的方法，對采自新疆伊犁貝殼相似的擬蛹螺屬2種蝸牛的貝殼形態(tài)，齒舌、顎片的電鏡掃描結構，生殖系統(tǒng)的解剖特征，線粒體基因（COⅠ）以及核基因（ITS1）的DNA序列進行詳盡的比較研究，確定它們的分類，其中一種為鉆擬蛹螺P.miser，另一種為新種吐爾根擬蛹螺P.tuegenensis sp. nov.。本研究首次應用比較形態(tài)解剖學和分子序列分析的方法探討該屬的分類問題，研究結果可以促進我國陸生貝類系統(tǒng)分類學的研究，也可為該類動物的防治提供數(shù)據(jù)基礎。

1?材料與方法

1.1?樣本

鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）6只標本（XJU E.13031）于2013年8月12日，采自新疆伊寧縣多浪農(nóng)場3隊（81°38′E，43°46′N，海拔721 m），采集人為張衛(wèi)紅;53只標本（XJU E.13003）于2015年4月17日，采自新疆新源縣鐵木里克村（83°08′E，43°33′N，海拔887 m），采集人為楊松（新種采集信息見新種描述）。標本處理參考陳德牛等的方法[9]，保存于無水乙醇中。Orculidae科與艾納螺科（Enidae）親緣關系較近[10]，故在NCBI數(shù)據(jù)庫中選取Orculidae科2個種：Schileykula trapezensis（Stojaspal，1981）、Sphyradium doliolum（Bruguiere，1792）的COⅠ基因序列作為外群用于系統(tǒng)發(fā)育關系分析，并選取數(shù)據(jù)庫中擬蛹螺屬所有種類的ITS1基因共4條序列以及艾納螺科相關種類COⅠ基因共7條序列用于參考分析（NCBI數(shù)據(jù)庫中僅有擬蛹螺屬部分種類ITS1的基因序列，沒有該屬種類COⅠ基因的序列）（表1）。

1.2?形態(tài)測量與比較

用游標卡尺（錫工牌0～150 mm）對2種各14只成體螺進行了測量。螺層數(shù)的計算采用Kerney等描述的方法[11]。貝殼照片用Nikon SMZ25數(shù)碼體式顯微鏡拍攝。在Olympus SZ2-ILST解剖鏡下對2種各3只成體螺進行軟體解剖[12]及齒舌、顎片電鏡樣品制備[13-14]。生殖系統(tǒng)解剖圖參考iphone手機拍攝的照片手繪完成。齒舌、顎片用LEO143OVT電子掃描顯微鏡掃描拍照。標本保存于新疆大學生命科學與技術學院。

1.3?分子分析

每種各3只標本，分別取腹足肌肉約30 mg，采用血液/細胞/組織基因組提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取基因組DNA。線粒體COⅠ基因PCR擴增引物參照文獻[15]：LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′），HCO2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）;核基因內(nèi)部轉錄間隔區(qū)ITS1基因PCR擴增引物參照文獻[16]：ITS1L（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGAT-3′），58C（5′-TGCGTTCAAGATATCGATGTTCAA-3′），引物由北京華大基因公司合成。PCR反應體系為20.0 μL，其中包括2×Taq PCR Master Mix10.0 μL、7.0 μL ddH2O、正反向引物各0.5 μL、DNA模板2.0 μL。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性1 min;94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，運行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。通過MEGA 5.0進行序列比對和編輯[17]，基于Kimura-2-parameter（K2P）模型進行遺傳距離分析，采用鄰接法（NJ）構建分子系統(tǒng)樹，利用Sequin軟件將序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中。

2?結果與分析

2.1?鉆擬蛹螺Pseudonapaeus miser（Martens，1874）（圖1，圖2-a）

Buliminus miser Martens，1874：21-22，fig.17.

Pseudonapaeus miser（Martens，1874）Schileyko，1952：204，fig.117.

Pseudonapaeus miser（Martens，1874）陳德牛，1987：56，fig.67.

Pseudonapaeus miser（Martens，1874）Sysoev，2009：68-69，fig.29I.

Pseudonapaeus miser（Martens，1874）錢周興，2013：56.

2.1.1?形態(tài)特征

貝殼：貝殼小型，殼質(zhì)厚，堅實，不透明，呈蛹形。有5.1～6.0個螺層。殼高7.78～10.92 mm[（9.26±0.36） mm]，殼寬3.34～4.72 mm[（4.10±0.36） mm]，殼口高2.76～4.12 mm[（3.47±0.31） mm]，殼口寬2.14～3.34 mm[（2.74±0.32） mm]。殼面黃棕色或淺黃棕色、光滑、有光澤，具有不均勻分布的稀疏生長線和螺紋特點，殼頂鈍、縫合線深，殼口呈橢圓形、口緣外折、臍孔狹小，呈縫隙狀。殼口具3齒，為軸唇齒、腔壁齒、腭壁齒（圖1-A至圖1-E）。

齒舌：角質(zhì)，長帶狀，其上具100～102行齒，齒式為（12～13） ∶（10～11） ∶1 ∶（10～11） ∶（12～13）。中央齒三錐型、主錐尖、呈菱形，明顯長于基板（圖1-F）。側齒雙錐型，主錐和外錐均比中央齒的大（圖1-G）。緣齒雙錐型，靠近外側的緣齒外錐常分裂為2～4枚小齒（圖1-H）。顎片小、幾丁質(zhì)、半月形、棕色，具明顯的縱行肋紋（圖1-I）。

生殖系統(tǒng)：陰莖圓柱狀，較長，陰莖基背板中等長度，鞭狀器退化幾乎闕如，具盲突、陰莖附屬器官各部分（A-1+A-2、A-3、A-4、A-5）均有發(fā)育。陰道短，陰道與游離輸卵管長度比為1 ∶3。受精囊管長，受精囊無柄，少數(shù)質(zhì)地較薄，受精囊管分支盲囊不膨大（圖2-A）。

棲息環(huán)境：鉆擬蛹螺生活在山區(qū)、丘陵地帶灌木叢以及農(nóng)田附近潮濕的草叢中，石塊或落葉下，有時也躲在石縫里。本研究的標本采自海拔為700～900 m天然草場的草叢中。

2.1.2?分類學比較

本研究的標本貝殼形態(tài)及大小與文獻中對鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）的描述[4-7，18]總體一致。但陳德牛等[5]和錢周興等[7]描述的該種標本貝殼呈角褐色，與本研究的標本略有差異;錢周興等描述的標本殼口具2枚齒[7]，與本研究的標本存在差異。本研究的標本貝殼形態(tài)與部分文獻中的描述略有差異，但是與模式標本的描述總體一致，并且陸生貝類同種不同種群、不同個體間貝殼形態(tài)會存在一定的變化[19]，綜合分析本研究的標本為鉆擬蛹螺。

2.2?吐爾根擬蛹螺

新種Pseudonapaeus tuergenensis sp.nov.（圖2-B、圖3），正模標本：殼高9.42 mm，殼寬4.48 mm，殼口高3.52 mm，殼口寬3.38 mm。2015年4月21日采自新疆伊犁新源縣吐爾根農(nóng)場（83°20′E，43°32′N，海拔911 m），1只（XJU E.13001），采集人楊松。

副模標本：殼高9.42～11.12 mm[（10.14±0.62） mm]，殼寬4.48～5.9 mm[（5.10±0.40） mm]，殼口高3.52～4.60 mm[（4.06±0.30） mm]，殼口寬3.38～4.00 mm[（3.70±0.23） mm]，43只（XJU E.13002），采集信息同正模。

2.2.1?形態(tài)特征

貝殼：貝殼小型、殼質(zhì)厚、堅實、不透明、呈塔形。有6.1～7.0個螺層，倒數(shù)第一、二螺層呈不均勻的灰白色或黃灰色，其余螺層呈淺棕色。殼面有光澤，具不均勻分布的稀疏生長線和螺紋;殼頂鈍;縫合線深;殼口呈橢圓形，口緣向外擴大。臍孔狹小，呈縫隙狀（圖3-A至圖3-D）。

齒舌：角質(zhì)，長帶狀，其上具90～92行齒，齒式為（12～13） ∶（9～10） ∶1 ∶（9～10） ∶（12～13）。中央齒三錐型，主錐尖、呈菱形、略長于基板（圖3-E）。側齒雙錐型，主錐和外錐均比中央齒的大（圖3-F）。緣齒雙錐型，靠近外側的緣齒外錐常分裂為2～4枚小齒（圖3-G）。顎片：小，幾丁質(zhì)，半月形，棕色，具縱行肋紋（圖3-H）。

生殖系統(tǒng)：陰莖圓柱狀，較短，陰莖基背板中等長度，鞭狀器退化幾乎闕如，具盲突。陰莖附屬器官（A-1+A-2、A-3、A-4、A-5）均有發(fā)育。陰道長，陰道與游離輸卵管長度比為1 ∶1.6。受精囊管中等長度，受精囊中等大小，橢球形，受精囊管無分支盲囊（圖2-B）。

2.2.2?分類學比較

吐爾根擬蛹螺P.tuergenensis sp. nov.與新種鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）均分布于新疆伊犁，它們的生境，貝殼質(zhì)地、大小和顏色及齒舌和顎片的形態(tài)結構相似。但鉆擬蛹螺貝殼較小，呈蛹形，殼口具3枚齒，陰莖較長，陰道較短，受精囊管有分支盲囊。新種貝殼較大，呈塔形，殼口無齒，陰莖較短，陰道較長，受精囊管無分支盲囊，與前者差異明顯[4，6-7]。

P.submucronatus（Lindholm，1927）分布于吉爾吉斯斯坦天山山脈，其貝殼呈塔形、殼口無齒，形態(tài)與新種相似。但P.submucronatus貝殼較大（殼高13～17 mm，殼寬7～9 mm），陰莖較長，鞭狀器明顯，陰道長（陰道與游離輸卵管長度比為3 ∶1），受精囊管有分支盲囊，與新種差異明顯[18]。由于缺少P.submucronatus的分子系統(tǒng)學數(shù)據(jù)，對于2種的比較有待進一步研究。

2.3?分子系統(tǒng)學分析

共測得10條基因序列，其中ITS1基因序列6條（鉆擬蛹螺、吐爾根擬蛹螺各3條），有效長度為610 bp;COⅠ基因序列4條（鉆擬蛹螺3條、吐爾根擬蛹螺1條），有效長度為651 bp，其中3條鉆擬蛹螺COⅠ基因共享一個單倍型。8條序列上傳至GenBank（MK131271～MK131276、MK138523～MK138524）。

基于COⅠ基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹結果（圖4）顯示，新種和鉆擬蛹螺以高支持率（后驗概率96%）與其他各屬種分開，形成一個單系（支系A），顯示二者有密切的親緣關系;但鉆擬蛹螺3個個體以高支持率（后驗概率100%）聚為一支，與新種產(chǎn)生分異?；贗TS1基因序列遺傳距離的結果（表2）顯示，新種與鉆擬蛹螺之間的遺傳距離為13.7%（12.5%～15.1%），顯著高于種內(nèi)遺傳距離（吐爾根擬蛹螺種內(nèi)遺傳距離為2.5%（1.3%～3.5%），鉆擬蛹螺的種內(nèi)遺傳距離為1.4%（1.2%～1.5%）且無重疊，顯示二者之間的遺傳分異已達到種的水平，為不同種。結合比較形態(tài)學的結果，進一步確定吐爾根擬蛹螺為一新種。

3?結論與討論

Martens 1874年建立P.miser時將其歸為Buliminus屬，后Schileyko（1952，1998）基于生殖系統(tǒng)的特征將其移入Pseudonapaeus屬（Pseudonapaeus屬鞭狀器退化幾乎闕如、陰莖基背板具盲突、陰莖末端無膨大現(xiàn)象;而Buliminus屬鞭狀器長、陰莖基背板無盲突、陰莖末端膨大）。依據(jù)線粒體COⅠ基因序列構建的艾納螺科7屬9種間的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，本研究中P.miser和新種以高支持率（后驗概率96%）形成支系A，與Buliminus屬2種形成的分支明顯分開，該結果支持P.miser不應隸屬于Buliminus屬。鉆擬蛹螺在我國僅分布于新疆，該種的內(nèi)部解剖結構和分子序列過去未見報道?本研究

首次對鉆擬蛹螺生殖系統(tǒng)以及齒舌、顎片的形態(tài)結構進行了描述并對其線粒體基因（COⅠ）和核基因（ITS1）的DNA序列進行了報道，為該種的準確鑒定提供了更詳盡的數(shù)據(jù)依據(jù)。

擬蛹螺屬目前在我國僅有本研究報道的2種。該屬分子數(shù)據(jù)貧乏，NCBI數(shù)據(jù)庫中僅有該屬4種4條ITS1基因序列數(shù)據(jù)，關于這2個種的系統(tǒng)發(fā)育位置有待后續(xù)研究。由于我國對該屬缺乏系統(tǒng)的研究，該類群對新疆農(nóng)牧區(qū)的危害情況尚屬未知。本研究結果為進一步研究該類群的分類學、生物學、生態(tài)學和害蟲防治提供了數(shù)據(jù)基礎。

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